Tris lub tris (hydroksymetylo)aminometan jest powszechnym buforem biologicznym, używanym w całym procesie ekstrakcji DNA. Podczas ekstrakcji z dowolnej liczby źródeł DNA jest wrażliwe na pH. Podczas lizy komórek, usuwania niechcianych składników komórkowych i wytrącania, tris stosuje się w celu utrzymania stabilnego pH. Dodatkowo odgrywa szczególnie ważną rolę w lizie komórek.
TL; DR (zbyt długi; Nie czytałem)
Ekstrakcja DNA jest procesem wrażliwym na pH, a użycie buforu Tris pomaga utrzymać stabilne pH podczas lizy komórek i ekstrakcji.
Tris jako bufor
Ponieważ pH może wpływać na wiele czynników komórkowych i być pod ich wpływem, utrzymanie stabilnego pH jest niezbędne w nauce doświadczalnej. Bufory biologiczne, takie jak tris, są ważne, ponieważ mogą utrzymywać stabilne pH pomimo wpływów, które w przeciwnym razie mogłyby zmienić pH. Tris (hydroksymetylo)aminometan o pKa 8,1 jest skutecznym buforem o pH od 7 do 9. Ze względu na swój neutralny zasięg, tris jest powszechnie stosowanym buforem w laboratoriach biologicznych. Jednak bufor Tris jest wrażliwy na temperaturę i powinien być stosowany w temperaturze, w której był pierwotnie pH, aby uniknąć niedokładności.
Liza komórek
Liza, czyli rozbicie komórek, jest pierwszym etapem ekstrakcji DNA. Odbywa się to za pomocą buforu zawierającego tris i EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy). EDTA wiąże dwuwartościowe kationy, takie jak wapń i magnez. Ponieważ jony te pomagają utrzymać integralność błony komórkowej, wyeliminowanie ich za pomocą EDTA destabilizuje błonę. Tris jest głównym składnikiem buforującym; jego główną rolą jest utrzymanie pH buforu na stałym poziomie, zwykle 8,0. Dodatkowo tris prawdopodobnie oddziałuje z LPS (lipopolisacharydem) w błonie, służąc do destabilizacji błony dalej.
Tris chroni DNA przed zmianami pH
Kiedy komórki zostają rozbite, ich DNA i zawartość rozlewają się do buforu. Dodatkowo często włącza się RNazę A (niszczy RNA), proteazy (niszczy białka) i SDS (dodecylosiarczan sodu, solubilizuje fragmenty błony). Podsumowując, ta zupa z zawartości komórek oraz pofragmentowanego RNA i białek może mieć duży wpływ na pH roztworu. Ponieważ DNA jest wrażliwe na pH, ważne jest, aby Tris buforował zupę i utrzymywał pH na stałym poziomie.
Precypitacja DNA
W końcowym etapie ekstrakcji DNA, z roztworu ekstrahuje się sam DNA. W tym momencie DNA jest rozpuszczalne w buforze. Aby wyekstrahować z roztworu, DNA czyni się nierozpuszczalnym przez dodanie etanolu lub izopropanolu (alkoholu izopropylowego). Kiedy to jest zrobione, DNA staje się oczywiste w roztworze jako biała, nitkowata substancja. Chociaż DNA można w ten sposób wyizolować z pozostałych składników komórkowych, nie jest on „użyteczny”, gdy jest nierozpuszczalny. Po izolacji alkohol jest usuwany, a DNA musi być zwrócone do biologicznego buforu, takiego jak Tris, w celu użycia.
Zrób to sam
Chociaż ekstrakcja DNA jest powszechnie wykonywana w laboratoriach badawczych, na ogół przy użyciu jednego z wielu dostępne na rynku zestawy, każdy może przeprowadzić ekstrakcję DNA w domu przy użyciu zwykłych artykułów gospodarstwa domowego i zieleni groszek lub szpinak. W tym przypadku tris ani żaden bufor biologiczny nie jest obecny w celu ochrony DNA przed zmianami pH. Jest to jednak wizualny sposób pomagania uczniom w łączeniu się z komórkowym DNA.