Plan genetyczny komórki jest zakodowany w jej materiale genetycznym, czyli DNA. Ponieważ DNA nigdy nie opuszcza jądra komórki, aby ta informacja dostała się do cytoplazmy, gdzie inne znajdują się białka i składniki biochemiczne, należy najpierw dokonać transkrypcji DNA na informacyjny RNA (mRNA lub poli (A) RNA). Ten mRNA zostaje następnie przetłumaczony na białka, które pełnią wiele funkcji komórki. Aby wykryć lub określić ilościowo bardzo rzadkie mRNA, stworzyć sondy do mikromacierzy lub skonstruować biblioteki komplementarnych cząsteczek DNA, mRNA musi zostać wyizolowany. Jednak ekstrakcja całkowitego RNA (tj. całego RNA w komórce) i późniejsza izolacja mRNA nie są procesami wzajemnie się wykluczającymi; to pierwsze musi być wykonane w celu ekstrakcji mRNA.
Homogenizacja TRIzol: Całkowity RNA obejmuje wszystkie mRNA, transferowe RNA, rybosomalne RNA i inne niekodujące RNA. Aby oddzielić je od innych składników komórkowych, komórka jest najpierw rozrywana, aby uwolnić swoje zawartość. Odbywa się to poprzez ponowne zawieszenie komórek osadzonych przez wirowanie (wirowanie z dużą prędkością) w odczynniku TRIzol (Life Technologies). Inne wersje TRIzolu (takie jak Ambion’s TRI Reagent) działają podobnie.
Całkowita izolacja RNA: Seria wirowań służy do rozdzielenia różnych składników (białek, DNA, RNA) komórki na warstwy lub fazy w zawiesinie. Górna faza o żółtym zabarwieniu składa się z tłuszczu i można ją wyrzucić. Pożądana faza jest zabarwiona na czerwono, zawiera całkowity RNA i jest zachowana. Po przeprowadzeniu ekstrakcji fenolowo-chloroformowej i serii przemywań alkoholem przy użyciu izopropanolu i etanolu, RNA można osadzić w celu izolacji mRNA. Dodaj inhibitory RNazy, aby zapobiec degradacji całkowitego RNA przez ten enzym.
Ekstrakcja mRNA: często używa się zestawu do izolacji mRNA, ponieważ domowe protokoły laboratoryjne nie generują dużych ilości wysoce oczyszczonych mRNA. Komercyjne zestawy obejmują FastTrack 2.0 firmy Invitrogen lub izolację Poly (A)Pure mRNA firmy Ambion Zestaw. Te podstawowe kroki są wspólne dla takich zestawów:
d) Odwiruj tę próbkę i odzyskaj supernatant, który jest kilkakrotnie płukany w serii buforów wiążących i o niskiej zawartości soli dostarczonych w zestawach.
Bibliografia
- "Protokoły biblioteki cDNA?"; Ian G. Cowell i Caroline A. Austin; 1997
- „Protokoły transkrypcji i translacji in vitro?”; Marcina J. Tymmy; 1995
Wskazówki
- Utrzymuj wszystkie odczynniki, komórki i RNA w niskiej temperaturze, zanurzając je w lodzie. Zapobiega to degradacji RNA przez inne enzymy uwalniane podczas procesu homogenizacji.
Ostrzeżenia
- Odczynniki takie jak TRIzol są toksyczne i nie mogą mieć kontaktu ze skórą ani błonami śluzowymi. Podczas pracy z tym odczynnikiem należy zawsze przestrzegać bezpiecznych protokołów laboratoryjnych.
o autorze
Palmer Owyoung posiada tytuł magistra w dziedzinie biznesu międzynarodowego na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Diego oraz and Bachelor of Arts z socjologii na Uniwersytecie Kalifornijskim w Santa Barbara i jest wyszkolonym molekularnym biolog. Od 2006 roku jest niezależnym pisarzem. Oprócz pisania jest pełnoetatowym traderem Forex i marketerem internetowym.
Kredyty fotograficzne
Jupiterimages/Photos.com/Getty Images