Bakterie hoduje się na szalkach Petriego na stałym podłożu znanym jako agar bakteryjny, na którym tworzą się podniesione, okrągłe kolonie. W przeciwieństwie do pojedynczej komórki bakteryjnej, kolonia to grupa bakterii wystarczająco duża, aby była widoczna gołym okiem. Wzrost bakterii można zmierzyć przez prostą obserwację liczby obecnych kolonii; jednak bardziej ilościowe metody obejmują zastosowanie komory zliczającej lub częściej zliczanie żywych płytek. Ten ostatni jest najczęściej używany, ponieważ dostarcza również informacji jakościowych, takich jak wpływ różnych warunków wzrostu. Ponieważ na szalce Petriego mogą znajdować się miliardy bakterii, pomiar najpierw wymaga rozcieńczenia próbki, aby można było policzyć liczbę kolonii.
W probówce dodać 10 mikrolitrów wyjściowej kultury bakteryjnej do 90 mikrolitrów pożywki rozcieńczającej. Zamknij szczelnie pokrywkę probówki i delikatnie worteksuj, aby uzyskać jednorodną mieszankę. Teraz próbka ma jedną dziesiątą swojego pierwotnego stężenia.
Przenieść 10 mikrolitrów tej nowej próbki do nowej probówki zawierającej 90 mikrolitrów pożywki rozcieńczającej, ponownie wymieszać. Po raz kolejny wynikiem będzie dalsze rozcieńczenie próbki - teraz będzie to jedna setna pierwotnego stężenia. Powtórz to kilka razy, aż oryginalna próbka zostanie rozcieńczona między 104 i 1010 czasy. Upewnij się, że każda probówka jest oznaczona odpowiednim rozcieńczeniem, na przykład 10-1, 10-2 i tak dalej.
Nanieść 10 mikrolitrów ostatniego zakończonego rozcieńczenia na płytkę agarową. Za pomocą krawędzi rozprowadzającej rozprowadź roztwór bakteryjny na całej powierzchni płytki agarowej. Powtórz to dla dwóch kolejnych talerzy. Dla porównania często wykonuje się te kroki z innymi poziomami rozcieńczenia. Upewnij się, że oznaczyłeś dna płyt. Załóż pokrywki na każdej płytce i pozostaw płytki agarowe do wyschnięcia przez kilka minut na stole laboratoryjnym pod ogniem lub w inkubatorze. Umieść płytki w inkubatorze, który powinien być ustawiony na odpowiednią temperaturę dla szczepu bakterii. Pozostaw do wzrostu na 12 do 16 godzin.
Kolonie powinny być widoczne po 16 godzinach; jednak niektóre modyfikacje genetyczne mogą wymagać dłuższego czasu (na przykład wybarwienie). Gdy kolonie są widoczne, wyjmij płytki i znajdź te, które mają od 30 do 300 kolonii. Używając markera permanentnego, umieść kropkę na dnie szalki Petriego – stronę z agarem, a nie pokrywką – wszędzie tam, gdzie przez agar widoczna jest kolonia. Policz każdą kropkę znacznika. Powtórz dla każdego dania.
Aby zmierzyć ilość bakterii w kulturze wyjściowej do tego eksperymentu, rozcieńczenie należy odwrócić w obliczeniach w dwóch miejscach. Po pierwsze, biorąc jeden mikrolitr z probówki do szalki Petriego, pobierałeś jedną dziesiątą rozcieńczonej próbki, więc musisz wszystko pomnożyć przez 10, aby to odwrócić. Dodatkowo, jeśli współczynnik rozcieńczenia w probówce wynosił np. 10-7, to liczbę kolonii należy pomnożyć przez 107 w celu odwrócenia efektu rozcieńczenia. Po prostu usuń ujemny znak z wykładnika w obliczeniach. Użyj wzoru:
[Liczba zliczonych kolonii] × 10 × [ile razy próbka musi zostać pomnożona, aby uzyskać pierwotne stężenie: na przykład 105] = Liczba jednostek tworzących kolonie (CFU) na mililitr kultury wyjściowej. To jest rozwój bakterii na twoich szalkach Petriego.
