Celmembranen bestaan uit fosfolipiden en aangehechte of ingebedde eiwitten. Membraaneiwitten spelen een vitale rol in het metabolisme en het leven van de cel. Je kunt geen gewone microscopie gebruiken om adhesie-eiwitten, transporteiwitten en eiwitkanalen in het celmembraan te visualiseren of te karakteriseren. Met behulp van elektronenmicroscopie en een techniek genaamd "freeze fracture", die bevroren celmembranen uit elkaar splitst, maakt visualisatie van de membraanstructuur en de organisatie van eiwitten in de zee van fosfolipiden. Het combineren van andere methoden met vriesfracturen helpt ons niet alleen om de structuur van verschillende celmembranen te begrijpen en membraaneiwitten, maar maakt de visualisatie en gedetailleerde analyse van de functie van specifieke eiwitten, bacteriën en virussen.
Basisstappen bij het bevriezen van een breuk
Met behulp van vloeibare stikstof worden biologische weefselmonsters of cellen snel ingevroren om celbestanddelen te immobiliseren. Celmembranen zijn samengesteld uit twee lagen fosfolipiden, een bilaag genaamd, waar de hydrofobe of waterhatende lipidestaarten naar de binnenkant van het membraan en de hydrofiele of waterminnende uiteinden van het lipidemolecuul wijzen naar buiten en naar de binnenkant van de cel. Het bevroren monster wordt gebarsten of gebroken met een microtoom, een mesachtig instrument voor het snijden van dunne weefselplakken. Hierdoor splitst het celmembraan zich precies tussen de twee lagen, omdat de aantrekkingskracht tussen de hydrofobe lipidestaarten het zwakste punt is. Na het breken ondergaat het monster een vacuümprocedure, genaamd "freeze etching". Het oppervlak van de gebroken monster wordt overschaduwd met koolstof- en platinadamp om een stabiele replica te maken, die de contouren van de breuk volgt vliegtuig. Zuur wordt gebruikt om organisch materiaal dat aan de replica kleeft te verteren, waardoor een dunne platina-omhulsel van het gebroken membraanoppervlak achterblijft. Deze schil wordt vervolgens geanalyseerd met elektronenmicroscopie.
Etsen bevriezen
Vriesetsen is het vacuümdrogen van een niet-gefixeerd, bevroren en gevriesfractureerd biologisch monster. De vacuümdroogprocedure is vergelijkbaar met het vriesdrogen van groenten en fruit die worden verpakt en verkocht in supermarkten. Zonder vriesetsen worden veel details van de celstructuur verdoezeld door ijskristallen. De diep- of vriesetsstap verbetert en breidt de oorspronkelijke vriesbreukmethode uit, waardoor celmembranen tijdens verschillende activiteiten kunnen worden waargenomen. Het maakt de analyse van niet alleen de membraanstructuur mogelijk, maar ook van intracellulaire componenten en geeft gedetailleerde structurele informatie over bacteriën, virussen en grote cellulaire eiwitten complexen.
Elektronenmicroscopie
Elektronenmicroscopie kan meer dan een miljoen keer de kleinste organismen of structuren onthullen en vergroten, zoals bacteriën, virussen, intracellulaire componenten en zelfs eiwitten. Visualisatie wordt gemaakt door een ultradun monster te bombarderen met een bundel elektronen. De twee elektronenmicroscopiemethoden zijn scanning-elektronenmicroscopie, of SEM, en transmissie-elektronenmicroscopie, of TEM. Freeze breukmonsters worden routinematig geanalyseerd met TEM. TEM heeft een betere resolutie dan SEM en biedt structurele informatie tot 3 nanometer replica's.
Onthullende celmembraanstructuur
De ontwikkeling en het gebruik van vriesbreukelektronenmicroscopie toonde aan dat celplasmamembranen zijn opgebouwd uit lipidedubbellagen en verduidelijkte hoe eiwitten in celmembranen zijn georganiseerd. Vriesbreuk geeft een unieke kijk op het binnenste van celmembranen, omdat het membraanfosfolipiden splitst en scheidt in twee tegenover elkaar liggende en complementaire vellen of vlakken. In de meer dan 50 jaar sinds de introductie van de eerste vriesbreukmachine is het maken van een platina-replica nog steeds de enige manier om structurele informatie over het celmembraan te verkrijgen. De techniek laat zien of bepaalde eiwitten drijven of verankerd zijn in het celmembraan, en of en hoe sommige eiwitten aggregeren. Een nieuwere methode - met behulp van antilichamen die zich richten op specifieke eiwitten - wordt gecombineerd met vriesbreuk om eiwitten en hun functie in het celmembraan te identificeren.