In de moleculaire biologie kan een goede bufferkeuze en voorbereiding voor verschillende DNA-isolatiestappen zijn: het verschil tussen doorgaan met eiwitexpressie of het openen van een andere maxi-prep-kit om te beginnen over. Ondanks hun cruciale belang, zijn bufferrecepten vaak precies dat: recepten geschreven zonder uitleg of reden voor de verschillende componenten. Een dergelijke buffer is glucose-tris-EDTA- of GTE-buffer.
Waar wordt GTE voor gebruikt?
GTE wordt gebruikt om bacteriële celpellets te resuspenderen voorafgaand aan het lyseren (openbreken) van de cellen en het oogsten van het plasmide-DNA erin. Lysozyme, dat de celmembranen verzacht, wordt vaak samen met de GTE-buffer toegevoegd. Het bereiken van een homogene suspensie van hele cellen tijdens deze stap, zodat de vervolgens toegevoegde lysisoplossing alle cellen kan bereiken, is de sleutel tot goede DNA-opbrengsten. GTE is ontworpen om dit te doen en tegelijkertijd een stabiele omgeving voor het DNA te bieden.
Glucose voor osmolariteit
50 mM (millimolair) glucosesuiker wordt toegevoegd aan de GTE-buffer om de osmolariteit te handhaven waar de concentratie van opgeloste stoffen buiten de cellen dicht bij die in de cellen ligt. Dit voorkomt voortijdige cellysis, wat kan leiden tot lagere DNA-opbrengsten als gevolg van aggregatie en afbraak. De andere componenten van de buffer dragen ook bij aan de osmolariteit van de oplossing, maar glucose, een niet-elektrolyt zijn, is een goede keuze omdat het de buffer van de oplossing niet verstoort eigendommen.
Tris voor pH-stabiliteit
Tris is de korte naam voor tris (hydroxymethyl)aminomethaan, een veel voorkomende pH-buffer. In het geval van GTE-buffer wordt het zuurzout (Tris-HCl) aan de buffer toegevoegd in een concentratie van 25 mM. Dit houdt de pH van de oplossing op een bijna fysiologische 8,0, een ideale pH voor het voorkomen van zure hydrolyse (afbraak) van het plasmide-DNA en ongewenste nevenreacties van de andere celcomponenten.
EDTA voorkomt DNA-afbraak
EDTA, of ethyleendiaminetetra-azijnzuur, vangt of "chelateert" metaalionen uit de oplossing, waardoor ze niet kunnen deelnemen aan ongewenste nevenreacties. In GTE-buffer wordt EDTA toegevoegd bij 10 mM. Het primaire doel is in de buffer om vrij zink, magnesium en calcium af te ronden, waardoor DNA-afbraak wordt voorkomen via bepaalde routes die die metalen nodig hebben.
Enkele belangrijke tips
Houd uw GTE-buffer koud en maak deze in kleine hoeveelheden om de groei van onbedoelde bacteriën erin te voorkomen. Suiker en de gecontroleerde pH zorgen voor een geweldig groeimedium. Gebruik altijd gezuiverd water. Kraanwater kan een overmaat aan metaalionen uit de leidingen bevatten, wat het vermogen van de EDTA om op te vangen kan overweldigen. Als u de aanwezigheid van storend RNA in uw monster vermoedt, voegt u RNase A met 100 microgram per milliliter toe aan uw GTE-buffer om het probleem op te lossen.