DNA-sequencing: definitie, methoden, voorbeelden

Nucleotiden zijn de chemische bouwstenen van het leven en worden aangetroffen in het DNA van levende organismen. Elk nucleotide bestaat uit een suiker, fosfaat en een stikstofhoudende base: adenine (A), thymine (T), cytosine (C) en guanine (G). De specifieke volgorde van deze nucleotidebasen bepaalt welke eiwitten, enzymen en moleculen door de cel worden gesynthetiseerd.

Het bepalen van de volgorde, of de volgorde van nucleotiden, is belangrijk voor de studie van mutaties, evolutie, ziekteprogressie, genetische testen, forensisch onderzoek en geneeskunde.

genomica is de studie van DNA, genen, geninteracties en omgevingsinvloeden op genen. Het geheim van het ontrafelen van de complexe innerlijke werking van genen is het kunnen identificeren van hun structuur en locatie op chromosomen.

De blauwdruk van levende organismen wordt bepaald door de volgorde (of volgorde) van nucleïnezuurbasenparen in DNA. Wanneer DNA repliceert, paren adenine met thymine en cytosine met guanine; niet-overeenkomende paren worden beschouwd mutaties.

Sinds de dubbele helix desoxyribonucleïnezuur (DNA-)molecuul werd in 1953 geconceptualiseerd, er zijn dramatische verbeteringen aangebracht op het gebied van genomica en grootschalige DNA-sequencing. Wetenschappers werken ijverig om deze nieuwe kennis toe te passen op geïndividualiseerde behandeling van ziekten.

Tegelijkertijd stellen voortdurende discussies onderzoekers in staat om de ethische implicaties van dergelijke snel exploderende technologieën voor te blijven.

DNA-sequencing is het proces waarbij de sequentie van verschillende nucleotidebasen in stukjes DNA wordt ontdekt. Whole-gen sequencing maakt vergelijkingen mogelijk van chromosomen en genomen die aanwezig zijn in dezelfde en verschillende soorten.

Het in kaart brengen van chromosomen is nuttig voor wetenschappelijk onderzoek. Analyse van de mechanismen en structuur van genen, allelen en chromosomale mutaties in DNA-moleculen suggereren bijvoorbeeld nieuwe manieren om genetische aandoeningen te behandelen en de groei van kankertumoren te stoppen.

De DNA-sequencingmethoden van Frederick Sanger het gebied van genomics vanaf de jaren zeventig enorm vooruitgegaan. Sanger voelde zich klaar om DNA-sequencing aan te pakken na het succesvol sequencen van RNA bij het bestuderen van insuline. Sanger was niet de eerste wetenschapper die zich bezighield met DNA-sequencing. Zijn slimme DNA-sequencingmethoden - ontwikkeld in samenwerking met collega's Berg en Gilbert - leverden echter in 1980 een Nobelprijs op.

Sanger kende de potentiële waarde van zijn werk en werkte vaak samen met andere wetenschappers die zijn interesse in DNA deelden, moleculaire biologie en levenswetenschappen.

Hoewel traag en duur in vergelijking met de huidige sequencing-technologieën, werden Sangers DNA-sequencing-methoden destijds geprezen. Na vallen en opstaan ​​vond Sanger het geheime biochemische "recept" voor het scheiden van DNA-strengen, het creëren van meer DNA en het identificeren van de volgorde van nucleotiden in een genoom.

Hoogwaardige materialen kunnen gemakkelijk worden gekocht voor gebruik in laboratoriumonderzoeken:

• DNA-polymerase is het enzym dat nodig is om DNA te maken.
• DNA-primer vertelt het enzym waar het aan de DNA-streng moet gaan werken.
• dNTP's zijn organische moleculen die bestaan ​​uit deoxyribosesuiker en nucleosidetrifosfaten - dATP, dGTP, dCTP en dTTP – die eiwitten assembleren
• Chain-terminators zijn kleurstofkleurige nucleotiden, ook wel terminatornucleotiden genoemd voor elke base - A, T, C en G.

Sanger ontdekte hoe je DNA in kleine segmenten kon knippen met behulp van het enzym DNA-polymerase.

Vervolgens maakte hij meer DNA van een sjabloon en plaatste radioactieve tracers in het nieuwe DNA om delen van de gescheiden strengen af ​​te bakenen. Hij erkende ook dat het enzym een ​​primer nodig had die zich kon hechten aan een specifieke plek op de matrijsstreng. In 1981 schreef Sanger opnieuw geschiedenis door het genoom van de 16.000 basenparen van mitochondriaal DNA te achterhalen.

De temperatuur moet zorgvuldig worden aangepast tijdens het sequentiëringsproces. Eerst worden chemicaliën aan een buis toegevoegd en verwarmd om de dubbelstrengs te ontrafelen (denatureren) DNA-molecuul. Daarna wordt de temperatuur afgekoeld, waardoor de primer kan hechten.

Vervolgens wordt de temperatuur verhoogd om optimale DNA-polymerase (enzym) activiteit te stimuleren.

Polymerase gebruikt meestal de normale beschikbare nucleotiden, die in een hogere concentratie worden toegevoegd. Wanneer polymerase een "keten-beëindigende" kleurstofgebonden nucleotide bereikt, stopt de polymerase en de keten eindigt daar, wat verklaart waarom de geverfde nucleotiden "ketenbeëindigend" of. worden genoemd "beëindigers."

Het proces gaat vele, vele malen door. Uiteindelijk is het kleurstofgebonden nucleotide op elke afzonderlijke positie van de DNA-sequentie geplaatst. Gelelektroforese en computerprogramma's kunnen vervolgens de kleurstofkleuren op elk van de DNA-strengen identificeren en bereken de hele DNA-sequentie op basis van de kleurstof, de positie van de kleurstof en de lengte van de strengen.

Sequentie met hoge doorvoer - in het algemeen aangeduid als sequentiëring van de volgende generatie – maakt gebruik van nieuwe ontwikkelingen en technologieën om nucleotidebasen sneller en goedkoper dan ooit tevoren te sequencen. Een DNA-sequencing-machine kan gemakkelijk grootschalige stukken DNA aan. In feite kunnen de volledige genomen in een kwestie van uren worden gedaan, in plaats van jaren met Sangers sequencing-technieken.

Sequentiemethoden van de volgende generatie kunnen DNA-analyse met een groot volume aan zonder de toegevoegde stap van amplificatie of klonen om voldoende DNA voor sequencing te krijgen. DNA-sequencing-machines voeren meerdere sequencing-reacties tegelijk uit, wat goedkoper en sneller is.

In wezen voert de nieuwe DNA-sequencingtechnologie honderden Sanger-reacties uit op een kleine, gemakkelijk leesbare microchip die vervolgens door een computerprogramma wordt geleid dat de sequentie samenstelt.

De techniek leest kortere DNA-fragmenten, maar is nog steeds sneller en efficiënter dan de sequencing-methoden van Sanger, zodat zelfs grootschalige projecten snel kunnen worden voltooid.

De Menselijk genoom project, voltooid in 2003, is een van de beroemdste sequencing-onderzoeken die tot nu toe zijn gedaan. Volgens een artikel uit 2018 in Wetenschapsnieuws, het menselijk genoom bestaat uit ongeveer 46.831 genen, wat een formidabele uitdaging was om te sequensen. Topwetenschappers van over de hele wereld hebben bijna 10 jaar samengewerkt en geraadpleegd. Geleid door het National Human Genome Research

Instituut bracht het project met succes het menselijk genoom in kaart met behulp van een samengesteld monster van anonieme bloeddonoren.

Het Human Genome Project vertrouwde op bacteriële kunstmatige chromosoom (BAC-gebaseerde) sequentiemethoden om basenparen in kaart te brengen. De techniek maakte gebruik van bacteriën om DNA-fragmenten te klonen, wat resulteerde in grote hoeveelheden DNA voor sequencing. De klonen werden vervolgens verkleind, in een sequencing-machine geplaatst en samengevoegd tot stukken die menselijk DNA vertegenwoordigen.

Nieuwe ontdekkingen op het gebied van genomica veranderen de benaderingen van ziektepreventie, -detectie en -behandeling ingrijpend. De overheid heeft miljarden dollars uitgetrokken voor DNA-onderzoek. Rechtshandhaving vertrouwt op DNA-analyse om zaken op te lossen. DNA-testkits kunnen worden gekocht voor thuisgebruik om voorouders te onderzoeken en genvarianten te identificeren die gezondheidsrisico's kunnen opleveren:

• Genomische analyse omvat het vergelijken en contrasteren van de genoomsequenties van veel verschillende soorten in de domeinen en koninkrijken van het leven. DNA-sequencing kan genetische patronen onthullen die nieuw licht werpen op wanneer bepaalde sequenties evolutionair werden geïntroduceerd. Voorouders en migratie kunnen worden getraceerd via DNA-analyse en vergeleken met historische gegevens.

• Vooruitgang in de geneeskunde gebeuren in een exponentieel tempo omdat vrijwel elke menselijke ziekte een genetische component heeft. DNA-sequencing helpt wetenschappers en artsen te begrijpen hoe meerdere genen met elkaar en met de omgeving omgaan. Door snel de DNA-sequentie te bepalen van een nieuwe microbe die een ziekte-uitbraak veroorzaakt, kunnen effectieve medicijnen en vaccins worden geïdentificeerd voordat het probleem een ​​ernstig probleem voor de volksgezondheid wordt. Genvarianten in kankercellen en tumoren kunnen worden gesequenced en gebruikt om geïndividualiseerde gentherapieën te ontwikkelen.

• Forensische wetenschap toepassingen zijn sinds het einde van de jaren tachtig gebruikt om wetshandhavers te helpen bij het oplossen van duizenden moeilijke gevallen, volgens de Nationaal Instituut voor Justitie. Bewijs op de plaats delict kan DNA-monsters van bot, haar of lichaamsweefsel bevatten die kunnen worden vergeleken met het DNA-profiel van een verdachte om schuld of onschuld vast te stellen. De polymerasekettingreactie (PCR) is een veelgebruikte methode om vóór sequencing kopieën van DNA te maken van sporenbewijs.

• Sequentiebepaling van nieuw ontdekte soorten kan helpen identificeren welke andere soorten het nauwst verwant zijn en informatie over evolutie onthullen. Taxonomen gebruiken DNA-barcodes om organismen te classificeren. Volgens de Universiteit van Georgië in mei 2018 zijn er naar schatting 303 soorten zoogdieren die nog ontdekt moeten worden.

• Genetische tests voor ziekten zoek naar gemuteerde genvarianten. De meeste zijn single nucleotide polymorphisms (SNP's), wat betekent dat slechts één nucleotide in de sequentie is gewijzigd ten opzichte van de "normale" versie. Omgevingsfactoren en levensstijl beïnvloeden hoe en of bepaalde genen tot uiting komen. Wereldwijde bedrijven stellen geavanceerde sequencing-technologieën van de nieuwe generatie ter beschikking van onderzoekers over de hele wereld die geïnteresseerd zijn in multigene interacties en sequencing van het hele genoom.

• Genealogische DNA-kits gebruiken DNA-sequenties in hun database om te controleren op varianten in de genen van een individu. De kit vereist een speekselmonster of wanguitstrijkje dat voor analyse naar een commercieel laboratorium wordt gestuurd. Naast informatie over de voorouders kunnen sommige kits single nucleotide polymorphisms (SNP's) of andere bekende genetische varianten zoals de BRCA1- en BRCA2-genen die geassocieerd zijn met een verhoogd risico op vrouwelijke borst- en eierstokkanker.

Nieuwe technologieën brengen vaak zowel sociale voordelen als schade met zich mee; voorbeelden zijn onder meer slecht functionerende kerncentrales en kernwapens voor massavernietiging. DNA-technologieën brengen ook risico's met zich mee.

Emotionele zorgen over DNA-sequencing en genbewerkingstools zoals CRISPR omvatten de angst dat de technologie kan het klonen van mensen vergemakkelijken of leiden tot gemuteerde transgene dieren die door een schurk zijn gemaakt wetenschapper.

Vaker hebben ethische kwesties met betrekking tot DNA-sequencing te maken met geïnformeerde toestemming. Gemakkelijke toegang tot direct-to-consumer DNA-testen betekent dat consumenten mogelijk niet volledig begrijpen hoe hun genetische informatie zal worden gebruikt, opgeslagen en gedeeld. Leken zijn misschien emotioneel niet klaar om meer te weten te komen over hun defecte genvarianten en gezondheidsrisico's.

Derden, zoals werkgevers en verzekeringsmaatschappijen, zouden mogelijk personen kunnen discrimineren die defecte genen dragen die tot ernstige medische problemen kunnen leiden.