De voordelen van het gebruik van Sticky End-enzymen

Moleculair klonen is een veelgebruikte biotechnologische methode waarmee elke student en onderzoeker bekend zou moeten zijn. Moleculair klonen met behulp van een type enzym dat een restrictie-enzym wordt genoemd om menselijk DNA in fragmenten te knippen die vervolgens in het plasmide-DNA van een bacteriële cel kunnen worden ingevoegd. Restrictie-enzymen knippen dubbelstrengs DNA doormidden. Afhankelijk van het restrictie-enzym kan de snede resulteren in een plakkerig uiteinde of een stomp uiteinde. Kleverige uiteinden zijn nuttiger bij moleculaire klonering omdat ze ervoor zorgen dat het menselijke DNA-fragment in de juiste richting in het plasmide wordt ingebracht. Het ligatieproces, of het samensmelten van DNA-fragmenten, vereist minder DNA wanneer het DNA plakkerige uiteinden heeft. Ten slotte kunnen meerdere kleverige-uiteinde-restrictie-enzymen hetzelfde kleverige uiteinde produceren, ook al herkent elk enzym een ​​andere restrictie-sequentie. Dit vergroot de kans dat uw DNA-gebied van belang kan worden uitgesneden door kleverige enzymen.

Restrictie-enzymen zijn enzymen die specifieke sequenties op dubbelstrengs DNA knippen en het DNA bij die sequentie doormidden knippen. De herkende sequentie wordt de restrictieplaats genoemd. Restrictie-enzymen worden endonucleasen genoemd omdat ze dubbelstrengs DNA knippen, zoals DNA normaal bestaat, op locaties tussen de uiteinden van het DNA. Er zijn meer dan 90 verschillende restrictie-enzymen. Elk herkent een afzonderlijke restrictieplaats. Restrictie-enzymen splitsen hun respectievelijke restrictieplaatsen 5.000 keer efficiënter dan andere plaatsen die ze niet herkennen.

Restrictie-enzymen zijn er in twee algemene klassen. Ze knippen DNA in plakkerige uiteinden of stompe uiteinden. Een plakkerig uiteinde heeft een kort gebied van nucleotiden, de bouwstenen van DNA, dat ongepaard is. Dit ongepaarde gebied wordt een overhang genoemd. Er wordt gezegd dat de overhang plakkerig is omdat het wil en zal paren met een ander plakkerig uiteinde met een complementaire overhangvolgorde. Kleverige uiteinden zijn als een verloren gewaande tweeling die elkaar stevig wil omhelzen zodra ze elkaar ontmoeten. Aan de andere kant zijn stompe uiteinden niet plakkerig omdat alle nucleotiden al gepaard zijn tussen de twee DNA-strengen. Het voordeel van plakkerige uiteinden is dat een fragment van menselijk DNA maar in één richting in een bacterieel plasmide past. Als daarentegen zowel het menselijke DNA als het bacteriële plasmide stompe uiteinden hebben, kan het menselijke DNA kop-aan-staart of staart-aan-kop in het plasmide worden ingebracht.

Hoewel DNA met stokuiteinden elkaar gemakkelijker kan vinden vanwege hun "plakkerigheid", kunnen noch plakkerige, noch stompe uiteinden samensmelten tot een doorlopend stuk DNA. Voor de vorming van een doorlopend stuk DNA dat volledig is verbonden, is een enzym nodig dat een ligase wordt genoemd. Ligasen verbinden de ruggengraat van nucleotiden aan de kleverige of stompe uiteinden, wat resulteert in een continue keten van nucleotiden. Omdat plakkerige uiteinden elkaar sneller vinden vanwege hun aantrekkingskracht op elkaar, vereist het ligatieproces minder menselijk DNA en minder plasmide-DNA. De stompe uiteinden van DNA en plasmiden zullen elkaar minder snel vinden, en dus vereist ligatie van stompe uiteinden dat er meer DNA in de reageerbuis wordt gedaan.

Restrictieplaatsen bevinden zich door het hele genoom van organismen, maar zijn niet gelijkmatig verdeeld. In plasmiden kunnen ze zo worden gemanipuleerd dat ze direct naast elkaar worden gelokaliseerd. Wetenschappers die een fragment van menselijk DNA uit het menselijk genoom willen knippen, moeten restrictieplaatsen vinden die zich voor en achter het gebied van het fragment bevinden. Naast ervoor te zorgen dat een DNA-fragment in de juiste richting wordt ingebracht, kunnen verschillende sticky end-enzymen hetzelfde sticky end creëren, ook al herkennen ze verschillende restrictiesequenties. BamHI, BglII en Sau3A hebben bijvoorbeeld verschillende herkenningssequenties, maar produceren hetzelfde GATC-kleverige uiteinde. Dit vergroot de kans dat er kleverige eindrestrictie-sites zijn die uw menselijke gen van belang flankeren.