Tris, of tris (hydroxymethyl) aminomethaan, is een veel voorkomende biologische buffer die tijdens het DNA-extractieproces wordt gebruikt. Tijdens extractie uit een aantal bronnen is DNA pH-gevoelig. Tijdens cellysis, verwijdering van ongewenste cellulaire componenten en precipitatie, wordt tris gebruikt om een stabiele pH te behouden. Bovendien speelt het een bijzonder belangrijke rol bij cellysis.
TL; DR (te lang; niet gelezen)
DNA-extractie is een pH-gevoelig proces en het gebruik van een tris-buffer helpt de pH stabiel te houden ten opzichte van cellyse en extractie.
Tris als buffer
Aangezien de pH een aantal cellulaire factoren kan beïnvloeden en kan worden beïnvloed door een aantal cellulaire factoren, is het handhaven van een stabiele pH essentieel voor experimentele wetenschap. Biologische buffers, zoals tris, zijn belangrijk omdat ze een stabiele pH kunnen behouden ondanks invloeden die anders de pH zouden kunnen verschuiven. Tris (hydroxymethyl)aminomethaan, met een pKa van 8,1, is een effectieve buffer tussen pH 7 en 9. Vanwege het neutrale bereik is tris een veelgebruikte buffer in biologische laboratoria. Tris-buffer is echter temperatuurgevoelig en moet worden gebruikt bij de temperatuur waarbij de pH oorspronkelijk was ingesteld om onnauwkeurigheid te voorkomen.
Lyse van cellen
Lysis, of het openbreken van de cellen, is de eerste stap van DNA-extractie. Dit wordt bereikt door een buffer die tris en EDTA (ethyleendiaminetetraazijnzuur) bevat. EDTA bindt tweewaardige kationen zoals calcium en magnesium. Omdat deze ionen helpen de integriteit van het celmembraan te behouden, destabiliseert het elimineren ervan met EDTA het membraan. Tris is de belangrijkste buffercomponent; zijn belangrijkste rol is om de pH van de buffer op een stabiel punt te houden, meestal 8,0. Bovendien, tris waarschijnlijk interageert met het LPS (lipopolysaccharide) in het membraan, wat dient om het membraan te destabiliserenstabil verder.
Tris Beschermt het DNA tegen pH-verschuivingen
Wanneer de cellen uit elkaar worden gehaald, komen hun DNA en inhoud in de buffer terecht. Bovendien worden vaak RNase A (vernietigt RNA), proteasen (vernietigt eiwitten) en SDS (natriumdodecylsulfaat, solubiliseert de membraanfragmenten) vaak opgenomen. Alles bij elkaar genomen kan deze soep van celinhoud en gefragmenteerd RNA en eiwitten een grote invloed hebben op de pH van de oplossing. Omdat DNA pH-gevoelig is, is het belangrijk voor tris om de soep te bufferen en de pH op een stabiel punt te houden.
DNA-precipitatie
In de laatste fase van DNA-extractie wordt het DNA zelf uit de oplossing geëxtraheerd. Op dit punt is het DNA oplosbaar in de buffer. Om uit de oplossing te extraheren wordt het DNA onoplosbaar gemaakt door toevoeging van ethanol of isopropanol (isopropylalcohol). Wanneer dit is gedaan, wordt het DNA in oplossing duidelijk als een witte, draadachtige substantie. Hoewel DNA op deze manier uit de resterende cellulaire componenten kan worden geïsoleerd, is het niet "bruikbaar" wanneer het onoplosbaar is. Na isolatie wordt de alcohol verwijderd en moet het DNA worden teruggestuurd naar een biologische buffer, zoals tris, om te worden gebruikt.
Doe het zelf
Hoewel extractie van DNA gewoonlijk wordt gedaan in onderzoekslaboratoria, wordt over het algemeen gebruik gemaakt van een van een aantal: in de handel verkrijgbare kits, iedereen kan thuis DNA-extractie doen met behulp van gewone huishoudelijke artikelen en groen erwten of spinazie. In dit geval is tris, noch enige biologische buffer, aanwezig om het DNA te beschermen tegen pH-verschuivingen. Het is echter een visuele manier om studenten te helpen verbinding te maken met cellulair DNA.