Hoe een DNA-monster wordt verzameld en klaargemaakt voor studie

Voordat ze DNA kunnen sequencen of veranderen door middel van genetische manipulatie, moeten wetenschappers het eerst isoleren. Dit lijkt misschien een moeilijke taak, aangezien cellen een grote verscheidenheid aan andere verbindingen bevatten, zoals eiwitten, vetten, suikers en kleine moleculen. Gelukkig kunnen biologen gebruikmaken van de chemische eigenschappen van DNA om DNA van deze verontreinigingen te scheiden en voor te bereiden voor verder onderzoek. Dit proces wordt DNA-extractie genoemd.

Er zijn veel verschillende technieken die worden gebruikt voor DNA-extractie. Welke door een individueel laboratorium wordt gebruikt, hangt af van het type experiment dat moet worden uitgevoerd en hoe zuiver het DNA moet zijn. Wetenschappers beginnen over het algemeen met een monster dat cellen bevat - bijvoorbeeld een weefsel- of bloedmonster - en breken de cellen open of lyseren ze. Er zijn verschillende manieren waarop u cellen kunt lyseren. Door een wasmiddel toe te voegen, zullen ze uit elkaar vallen, net als ze worden blootgesteld aan hoogfrequente geluidsgolven. Als alternatief zal het mengen van het monster met glasparels en het snel trillen ervan de cellen fysiek uit elkaar breken en hun inhoud vrijgeven.

Als hoge zuiverheid niet vereist is, kunnen wetenschappers een enzym toevoegen dat proteïnase K wordt genoemd om de meeste eiwitten in het monster af te breken en het vervolgens gebruiken zoals het is. Deze techniek is echter erg vuil, omdat de meeste verontreinigingen nog steeds aanwezig zijn, dus het is alleen geschikt als snelheid een prioriteit is en zuiverheid geen probleem is. Een andere snelle en vuile benadering is om eiwitten te verwijderen door de zoutconcentratie te verhogen door zouten zoals ammonium of kaliumacetaat toe te voegen om de eiwitten te laten neerslaan. Ook deze techniek is vrij vuil aangezien er nog veel andere verontreinigingen aanwezig zijn.

Een andere benadering is om de cellen te lyseren met wasmiddel en de oplossing vervolgens te mengen met isoamylalcohol, chloroform en fenol. De oplossing scheidt zich vervolgens in twee lagen. Eiwitten komen terecht in de bovenste organische laag, terwijl DNA in de onderste waterige laag achterblijft. Deze techniek vereist een zorgvuldige controle van de zoutconcentratie en pH voor goede resultaten. Het is tijdrovend en zowel fenol als chloroform zijn zeer giftige chemicaliën. Bijgevolg, terwijl extracties met fenol-chloroform ooit routine waren, zijn andere technieken de laatste jaren populairder geworden.

Anionenuitwisselingschromatografie biedt een hogere zuiverheid en consistentere resultaten dan fenol-chloroformextractie. Een buis of kolom is gepakt met kleine deeltjes met daarop positief geladen plaatsen waar een negatief geladen molecuul of anion zich kan binden. DNA bindt aan deze anionenuitwisselingsplaatsen terwijl andere verontreinigingen zoals eiwitten en RNA van de kolom worden gewassen. Later wordt een zoutrijke oplossing gebruikt om het DNA van de kolom te trekken.

De snelste en misschien wel meest betrouwbare techniek voor het zuiveren van DNA is het gebruik van een speciaal vervaardigde kit. Deze kits bevatten silicagelmembranen in een tube. Het DNA plakt aan het membraan terwijl andere verontreinigingen worden weggespoeld met behulp van een reeks speciaal bereide zoutoplossingen die bij de kit worden geleverd. Ten slotte wordt het DNA van de kolom gewassen met een zoutarme oplossing. Deze kits zijn snel, gemakkelijk te gebruiken en bieden reproduceerbare resultaten.

Nadat het DNA is geïsoleerd en opnieuw is gesuspendeerd in een pH-gecontroleerde bufferoplossing, is de laatste stap het testen van de zuiverheid ervan. Een gemakkelijke en handige manier om dit te doen, is door te controleren hoeveel ultraviolet licht het absorbeert bij de golflengten van 260 en 280 nanometer. De absorptie bij 260 nanometer gedeeld door de absorptie bij 280 nanometer zou gelijk moeten zijn aan 1,8 als het DNA zuiver is. Door de absorptie bij 260 nanometer te meten, kun je ook de concentratie van het DNA bepalen.