Recombinant DNA (deoxyribonucleïnezuur) is een synthetisch type nucleïnezuur dat wordt gemaakt door DNA te koppelen sequenties samen die van nature niet zouden bestaan onder normale omstandigheden en omgevingsfactoren voorwaarden.
Het proces van het maken van recombinant DNA wordt meestal gedaan met een recombinant plasmide. In het bijzonder is het gemaakt door een geavanceerde DNA-technologieprocedure in de biologie en genetica die bekend staat als genklonering. Recombinant DNA wordt in een cel gestopt, die vervolgens een volledig nieuw eiwit produceert, en wordt gebruikt om medicijnen, antilichamen of specifieke eiwitten te synthetiseren, alleen voor onderzoek.
Inleiding over recombinant-DNA-technologie
DNA van een donororganisme of biologische bron wordt eerst uit cellen geëxtraheerd en vervolgens onderworpen aan een snijproces dat bekend staat als enzymatische restrictie. Dit genereert fragmenten van DNA die het gen of de genen van belang bevatten. Deze fragmenten kunnen vervolgens worden "gekloneerd" (d.w.z. ingevoegd) of op fragmenten van het ontvangende organisme worden geplakt.
Ze worden vervolgens ingevoegd in grotere DNA-moleculen (een "recombinant plasmide"), die in een bacterie worden geplaatst en zich mogen vermenigvuldigen. Het recombinante DNA wordt vervolgens gewonnen en geverifieerd.
Lees meer over de voor- en nadelen van recombinant-DNA-technologie.
DNA-isolatie
DNA moet eerst worden geëxtraheerd en gezuiverd uit andere cellulaire moleculen, zoals ribonucleïnezuren (RNA's), eiwitten en structuren zoals celmembranen. Voor kloneringsdoeleinden wordt DNA verkregen uit de kern en staat bekend als "genomisch DNA". Een veelgebruikte methode voor DNA extractie is door ultracentrifugatie van celcomponenten in een dichtheidsgradiënt bestaande uit ethidiumbromide in cesium chloride.
Als alternatief kan een reeks alkalische en zoutbufferwassingen ook worden gebruikt om het DNA terug te winnen. Zodra dit is neergeslagen en ontdaan van alle andere ongewenste verontreinigingen, kan het DNA in fragmenten worden gesneden.
Beperking Enzym Vertering van DNA
Restrictie-enzymen zijn enzymen die zeer specifieke DNA-sequenties opknippen; ze worden gebruikt om unieke DNA-fragmenten te maken. Dit proces zorgt ervoor dat er geen onnauwkeurige, onjuiste of ongewenste reeksen worden gegenereerd en per ongeluk opgenomen in het uiteindelijke recombinante DNA, wat kan leiden tot zowel experimenteel falen als celdood.
Om de gewenste DNA-fragmenten te genereren, wordt een specifieke enkele (of combinatie van) enzym(en) gebruikt om het DNA te knippen of te verteren. De fragmenten worden vervolgens gezuiverd door gelelektroforese, die ze scheidt van het ongewenste DNA. Een ruwere methode van DNA-technologie omvat eenvoudigweg mechanisch knippen, waarbij de langere DNA-segmenten worden verscheurd in kleinere die kunnen worden gebruikt voor klonen.
DNA-ligatie
Ligatie is het proces van het aan elkaar plakken of samenvoegen van de DNA-fragmenten van de donor en de ontvanger (of vector) om een recombinant plasmide-DNA-molecuul te creëren. Idealiter zouden de restrictie-enzymen die zijn gekozen om de fragmenten te maken, zeer zorgvuldig zijn uitgedacht en zo zijn ontworpen dat ze het mogelijk maken om deze stukjes in elkaar te zetten als een legpuzzel.
Om dit te doen hebben restrictie-enzymen die compatibele "kleverige uiteinden" produceren de voorkeur, zodat alle compatibele fragmenten op natuurlijke wijze met elkaar zullen verbinden. Anders kan het DNA-ligase-enzym worden gebruikt om de DNA-segmenten te verbinden met fosfodiesterbindingen.
Recombinante DNA-replicatie
Het proces van transformatie of hitteschok wordt gebruikt om het recombinante DNA-molecuul in een bacteriële gastheercel te plaatsen, die vervolgens vele kopieën van het synthetische DNA kan genereren. Deze bacteriën worden gekweekt op agarplaten, gekweekt in speciale bacteriële bouillons en vervolgens gelyseerd om het recombinante DNA vrij te maken. Ten slotte kan het DNA worden geverifieerd door DNA-sequencing, functionele experimenten en digestie met restrictie-enzymen.
Gebruik voor recombinant DNA
Recombinante DNA-technologie wordt voor alles gebruikt, van academische laboratoriumexperimenten tot het maken van farmaceutische medicijnen. Het is ook een belangrijk onderdeel van DNA-sequencing en genidentificatie.
U kunt hier meer over lezen: DNA-technologie hier.
Lees meer over het verschil tussen recombinant DNA en genetische manipulatie.