Gēla elektroforēzes trūkumi

Gēla elektroforēze ir paņēmiens, kurā bioloģiskās molekulas tiek atdalītas viena no otras un identificētas bioloģiskajos pētījumos vai medicīniskajā diagnostikā. Kopš to izstrādes pagājušā gadsimta 70. gados šie paņēmieni ir bijuši nenovērtējami, identificējot gēnu (DNS) un gēnu produktus (RNS un olbaltumvielas), kas interesē pētniecību. Pēdējos gados ir parādījušās jaunākas metodes, kas piešķir lielāku specifiku un detalizētāku informāciju par to, kas notiek dzīvajās sistēmās. Lai gan tie nav aizstājuši elektroforēzes paņēmienus, un uzlabotas manipulācijas var paplašināt tehnikas dzīvotspēju, ir svarīgi saprast, ko gēla elektroforēze var un ko nevar darīt.

Elektroforēze ir raksturīga visiem audiem, no kuriem esat izlasījis. Piemēram, ja jūs veicat Southern blot (elektroforēzes veidu) uz vaigu tampona, jūs skatāties uz gēniem no vaiga epitēlija šūnām un nekur citur jūsu ķermenī. Reizēm tas var būt izdevīgi, taču pētniekus bieži interesē plašāka ietekme.

Tādi paņēmieni kā hibridizācija in situ (ISH) var veikt audu daļu un analizēt gēnu ekspresiju katrā nelielajā šī parauga laukumā. Tādējādi pētnieki var apskatīt katru smadzeņu zonu paraugā ar ISH, savukārt elektroforēzes paņēmieni vienlaikus var aplūkot tikai dažas zonas.

Ar gēla elektroforēzi var efektīvi atdalīt līdzīgus proteīnus ar dažādu svaru (šo metodi sauc par Western blotting). Tas tos var precīzāk atdalīt, izmantojot tehniku, kas pazīstama kā 2d elektroforēze; tas ir izplatīts proteomikā.

Diemžēl visi mērījumi, kas veikti ar šo tehniku, labākajā gadījumā ir daļēji kvantitatīvi. Lai iegūtu precīzu olbaltumvielu masu (masu), pēc olbaltumvielu attīrīšanas ar elektroforēzi jāveic masas spektroskopija. Turklāt, salīdzinot dažādu molekulu relatīvo daudzumu, ir atkarīgs no dažādu plankumu joslas blīvuma (tumšuma) uz gēla. Šai metodei ir zināma kļūda, un paraugi parasti tiek palaisti vairākas reizes, lai iegūtu tīrus rezultātus.

Elektroforēze ir dažādu biomolekulu izolēšanas un vizuālas identificēšanas paņēmiens. Tas tiek darīts, elektrisko strāvu izlaižot caur gēlu, lai atdalītu dažāda svara lādētas molekulas. Ja jūs interesējošā molekula nav pietiekami izplatīta, tās josla būs praktiski neredzama un to būs grūti izmērīt.

Pirms elektroforēzes veikšanas DNS un RNS var nedaudz pastiprināt, taču to nav praktiski izdarīt ar olbaltumvielām. Tādēļ šo testu veikšanai ir nepieciešams liels audu paraugs. Tas var ierobežot metodes lietderību, īpaši medicīniskajā analīzē. Praktiski nav iespējams vadīt elektroforēzi no vienas šūnas paraugiem; plūsmas citometriju un imūnhistoķīmiju biežāk izmanto, lai novērtētu olbaltumvielu ekspresiju šūnās pa šūnām. Tehnika, ko sauc par PCR, ir lieliska, lai precīzi izmērītu nelielu RNS daudzumu.

Elektroforēze lieliski atdala un identificē vidēja un liela izmēra biomolekulas. Tomēr daudzas molekulas, kuras pētnieki vēlas apskatīt, ir mazākas; mazos hormonus, neirotransmiterus un jonus nevar izmērīt ar elektroforēzi. Tas ir divu iemeslu dēļ: tie pienācīgi nereaģē ar elektroforēzes sagatavošanu (parasti tehnika ko sauc par SDS PAGE), un, pat ja viņi to izdarīja, tie ir pārāk mazi, lai pareizi atdalītos, un tie izskrietu no apakšas želeja. Šīs molekulas tā vietā mēra ar tādām metodēm kā RIAA (radio imūnanalīzes) un ELISA (ar enzīmiem saistīts imūnsorbcijas tests).

Gēla elektroforēze parasti ir maza caurlaidspēja, tas nozīmē, ka tā nerada datus īpaši ātri. Kontrasta elektroforēze, kurā vienlaikus var apskatīt nelielu sauju RNS molekulu ar PCR (polimerāzes ķēdes reakcija), kas vienlaikus var novērtēt tūkstošiem paraugu. Līdzīgi plūsmas citometrija var veikt mērījumus no tūkstošiem atsevišķu šūnu un padarīt to sarežģītu korelācijas, kamēr elektroforēze masveidā aplūko šūnas un nevar padarīt tik smalku diskriminācijas. PCR un plūsmas citometrija attiecīgi atspoguļo masveidā paralēlus un sērijveida procesus, un abi tālu pārsniedz elektroforēzes spējas radīt pētījumu datus.