Kā aprēķināt DNS fragmentu garumu

Kad jāmēra DNS fragmentu garums, kas ir daudz mazāks nekā šūnas, mikrobiologiem ir nepieciešams triks, un ērtākais ir gēla elektroforēze. Šī metode balstās uz faktu, ka DNS fragmenti tiek uzlādēti, un tā ir alternatīva dārgākām metodes, piemēram, rentgena kristālogrāfija, kas bija atbildīga par dubultās spirāles struktūras atklāšanu DNS.

Tā kā DNS molekulas ir uzlādētas, tās ietekmē elektriskā strāva. Kad jūs tos ievietojat neitrālā želejā un visā gēlā ievietojat strāvu, molekulas migrē pozitīvā elektroda (anoda) virzienā. Tā kā dažāda izmēra DNS molekulām ir vienāds lādiņš, mazākās pārvietojas ātrāk, tāpēc šis process molekulas atdala joslās, kuras var salīdzināt ar zināmu izmēru paraugiem.

Gelu parasti ražo no agarozes - polisaharīda, kas, sildot buferšķīdumā, veido daļēji cietu, nedaudz porainu gēlu. Vienā galā gēls veido sīkus ievilkumus, ko sauc par akām, kur pētnieks ievieto pētāmos DNS paraugus, kā arī zināmā garuma atsauces paraugus, ko sauc par DNS kāpnēm. Kāpņu fragmentu garumi ir iepriekš noteikti ar citu metodi, piemēram, ar rentgena kristālogrāfiju.

Kad želeja ir iegremdēta vadošā šķīdumā un tiek pielietots spriegums, fragmenti sāk migrēt caur gēlu - vispirms mazākie un aizmugurē esošie lielākie, lēnākie. Viņi galu galā veido sevi spektram līdzīgās joslās pēc lieluma.

Kad tas notiek, pētnieks izslēdz strāvu, ievada želeju ar DVA saistošo krāsu un pārbauda paraugus ultravioletajā gaismā. Izmantojot kāpnes kā atsauci, pētnieks var noteikt katra fragmenta izmēru redzamajā joslā. Ir redzamas tikai joslas - atsevišķi DNS fragmenti ir pārāk mazi, lai tos redzētu.

Iespējams, ka ne katra parauga josla pārī apvienojas ar joslu uz kāpnēm, tāpēc, lai noteiktu šo nezināmo fragmentu izmērus, zinātnieki parasti izliek grafiku. Uz x ass ir attālums, ko katra joslā trepēs nobraukusi milimetros, savukārt uz y ass ir katras joslas lielums. Kad punktus savieno līkne, jebkuras joslas izmēru var ekstrapolēt no līknes, mērot šīs joslas nobraukto attālumu milimetros.