DNS klonēšana: definīcija, process, piemēri

Ir iespējams klonēt veselus organismus, piemēram, aitu Dolliju, taču DNS klonēšana ir atšķirīga. Tās izgatavošanai tiek izmantotas molekulārās bioloģijas metodes identiskas DNS secību vai atsevišķu gēnu kopijas.

Izmantojot gēnu inženierijas metodes, tiek identificēti un izolēti DNS ģenētiskā koda segmenti. Pēc tam DNS klonēšana kopē nukleīnskābe secības segmentos.

Iegūtās identiskās kopijas var izmantot turpmākiem pētījumiem vai biotehnoloģijas lietojumiem. Bieži vien kopētais gēns kodē olbaltumvielu, kas var būt daļa no medicīniskās ārstēšanas. DNS tehnoloģija, ieskaitot DNS klonēšana atbalsta izpratni par to, kā darbojas gēni un kā cilvēka ģenētiskais kods ietekmē ķermeņa darbību.

DNS klonēšana ir molekulārās bioloģijas process, ar kuru tiek izgatavotas identiskas DNS segmentu kopijas, kas atrodas hromosomās, kurās ir uzlabotu organismu ģenētiskais kods.

Process rada lielu daudzumu mērķa DNS sekvences. DNS klonēšanas mērķis ir radīt pašas mērķa DNS sekvences vai radīt mērķa sekvencēs kodētos proteīnus.

Tiek sauktas divas DNS klonēšanā izmantotās metodes plazmīdu vektors un polimerāzes ķēdes reakcija (PCR). Iekš plazmīdu vektors metodi DNS virknes tiek sagrieztas, izmantojot restrikcijas fermenti lai iegūtu DNS fragmentus, un iegūtie segmenti tiek ievietoti klonēšanas vektoros, kurus sauc par plazmīdiem, lai tos atkārtotu. Plazmīdas ievieto baktēriju šūnās, kas pēc tam ražo DNS kopijas vai kodētos proteīnus.

Iekš PCR metode, dublējamo DNS virkņu segments ir apzīmēts ar saucamajiem enzīmiem gruntskrāsas. Polimerāzes ferments veido DNS virknes iezīmētās daļas kopijas. Šī metode neizmanto restrikcijas enzīmus, un no maziem paraugiem tā var ražot klonētu DNS. Dažreiz abas DNS tehnoloģijas metodes tiek izmantotas kopā, lai iekļautu katras labākās īpašības kopējā reakcijā.

Metodes vektors attiecas uz plazmīdu, ko izmanto, lai noturētu klonējamo DNS mērķa segmentu. Plazmīdi ir mazi apļveida pavedieni nehromosomu DNS atrodams daudzos organismos, ieskaitot baktērijas un vīrusus.

Baktēriju plazmīdas ir vektors, ko izmanto mērķa DNS segmenta ievietošanai baktēriju šūnās turpmākai dublēšanai.

Mērķa DNS atlase un izolēšana: Pirms var sākties DNS klonēšanas process, ir jāidentificē DNS sekvences, it īpaši DNS segmentu sākumi un gali.

Šādas DNS sekvences var atrast, izmantojot esošo klonēto DNS ar zināmām sekvencēm vai pētot proteīnu, ko ražo mērķa DNS secība. Kad secība ir zināma, var izmantot attiecīgos restrikcijas enzīmus.

Mērķa DNS sagriešana ar restrikcijas enzīmiem: Ierobežojošie fermenti tiek izvēlēti, lai meklētu DNS kodu mērķa secības sākumā un beigās.

Kad restrikcijas fermenti atrod īpašu kodētu bāzes pāru secību, ko sauc par restrikcijas vietām, tie piestiprināties pie DNS šajā vietā un vīt sevi ap DNS molekulu, atdalot dzīsla. Izgrieztie DNS segmenti, kas satur mērķa secību, tagad ir pieejami dublēšanai.

Plazmīdu vektora izvēle un mērķa DNS ievietošana: Piemērotā plazmīdā ideālā gadījumā ir tādas pašas DNS kodējošas sekvences kā DNS virknē, no kuras tika izgriezta mērķa DNS. Plasmīdas apļveida DNS virkne tiek sagriezta ar tiem pašiem restrikcijas enzīmiem, kas tika izmantoti mērķa DNS sagriešanai.

A DNS ligāzes ferments tiek izmantots, lai veicinātu DNS segmentu sasaisti, un mērķa DNS segmenta gali sasaistās ar plazmīdās DNS sagrieztajiem galiem. Mērķa DNS tagad veido apļveida plazmīda DNS virknes daļu.

Plazmīda ievietošana baktēriju šūnā: Kad plazmīdā ir klonējamā DNS secība, faktiskā klonēšana var notikt, izmantojot procesu, ko sauc baktēriju transformācija. Plazmīdas tiek ievietotas baktēriju šūnā, piemēram, E. coli, un šūnas ar jaunajiem DNS segmentiem sāks ražot kopijas un atbilstošās olbaltumvielas.

Baktēriju transformācijā saimniekorganisma šūnas un plazmīdas tiek inkubētas kopā ķermeņa temperatūrā apmēram 12 stundas. Šūnas absorbē dažas plazmīdas un izturas pret tām pret savu plazmīdu DNS.

Klonētās DNS un olbaltumvielu ievākšana: Lielākajai daļai plazmīdu, ko izmanto DNS klonēšanai, ir antibiotiku rezistences gēni iekļauti viņu DNS. Kad baktēriju šūnas absorbē jaunās plazmīdas, tās kļūst izturīgas pret antibiotikām.

Apstrādājot kultūru ar antibiotikām, izdzīvo tikai tās šūnas, kas absorbējušas jaunās plazmīdas. Rezultāts ir tīra baktēriju šūnu kultūra ar klonētu DNS. Pēc tam šo DNS var savākt vai iegūt atbilstošu olbaltumvielu.

The PCR metode ir vienkāršāka un kopē esošo DNS vietā. Tas neprasa griešanu ar ierobežojošiem enzīmiem vai ievietošanu plazmīdsDNS secības. Tas padara to īpaši piemērotu DNS paraugu klonēšanai ar ierobežotu skaitu DNS virkņu. Lai gan šī metode var klonēt DNS, to nevar izmantot atbilstoša proteīna ražošanai.

DNS virkņu atritināšana: DNS hromosomās ir cieši savijies dubultās spirāles struktūrā. DNS uzkarsēšana līdz 96 grādiem pēc Celsija procesā, ko sauc denaturēšana liek DNS molekulai atlocīties un sadalīties divos pavedienos. Šī atdalīšana ir nepieciešama, jo vienlaikus var klonēt tikai vienu DNS virkni.

Gruntskrāsu izvēle: Tāpat kā plazmīdu vektoru DNS klonēšanā, arī klonējamās DNS sekvences ir jāidentificē, īpaši uzsverot DNS segmentu sākumu un galus. Primeri ir fermenti, kas pievienojas specifiskām DNS koda sekvencēm, un tie ir jāizvēlas, lai iezīmētu mērķa DNS segmentus. Pareizie grunti piestiprināsies pie DNS molekulu sekvencēm, lai iezīmētu mērķa segmentu sākumu un galus.

Reakcijas atkausēšana, lai saistītu grunti: Tiek saukta reakcijas atdzišana līdz aptuveni 55 grādiem pēc Celsija atkvēlināšana. Reakcijai atdziestot, grunti tiek aktivizēti un piestiprinās DNS virknei katrā mērķa DNS segmenta galā. Gruntskrāsas darbojas tikai kā marķieri, un DNS virkne nav jāgriež.

Mērķa DNS segmenta identisku kopiju izgatavošana: Procesā, ko sauc pagarinājums, reakcijai pievieno karstumjutīgo TAQ polimerāzes enzīmu. Pēc tam reakciju silda līdz 72 grādiem pēc Celsija, aktivizējot fermentu. Aktīvais DNS polimerāzes enzīms saistās ar primeriem un kopē starp tiem DNS secību. Sākotnējais DNS sekvencēšanas un klonēšanas process ir pabeigts.

Klonētas DNS ražas palielināšana: Sākotnējais atlaidināšanas un pagarināšanas process rada salīdzinoši maz pieejamo DNS virknes segmentu kopiju. Lai palielinātu ražu, izmantojot papildu DNS replikāciju, reakciju atkal atdzesē, lai atkārtoti aktivizētu gruntējumus un ļautu tiem saistīties ar citiem DNS pavedieniem.

Pēc tam, atkārtoti uzkarsējot reakciju, atkal tiek aktivizēts polimerāzes enzīms, un tiek iegūti vairāk kopiju. Šo ciklu var atkārtot 25 līdz 30 reizes.

Plazmīdu vektora metode balstās uz plašu sākotnējo DNS piegādi, lai sagrieztu un ievietotu plazmīdās. Pārāk maz oriģinālās DNS rada mazāk plazmīdu un lēnu klonētās DNS ražošanas sākumu.

PĶR metode var radīt lielu daudzumu DNS no dažiem oriģinālajiem DNS pavedieniem, taču, tā kā DNS netiek implantēta baktēriju šūnā, olbaltumvielu ražošana nav iespējama.

Lai ražotu olbaltumvielu, kas kodēts DNS fragmentos, kas jāklonē no neliela sākotnējā DNS parauga, abas metodes var izmantot kopā, un tās var papildina viens otru. Vispirms tiek izmantota PCR metode, lai klonētu DNS no neliela parauga un iegūtu daudzas kopijas.

Tad PCR produktus izmanto ar plazmīdu vektora metodi, lai saražoto DNS implantētu baktēriju šūnās, kas ražos vēlamo olbaltumvielu.

Molekulārā bioloģija izmanto gēnu klonēšanu un DNS replikāciju medicīniskiem un komerciāliem mērķiem. Baktērijas ar klonētām DNS sekvencēm tiek izmantotas, lai ražotu zāles un aizstātu vielas, kuras cilvēki ar ģenētiskiem traucējumiem paši nespēj ražot.

Parasti izmanto:

• Gēns cilvēka insulīns tiek klonēts baktērijās, kas pēc tam ražo insulīnu, ko lieto diabētiķi.
• Audu plazminogēna aktivatoru ražo no klonētas DNS un izmanto, lai palīdzētu novērstu asins recekļu veidošanos.
• Cilvēka augšanas hormons var ražot un ievadīt cilvēkiem, kuri paši to nevar ražot.

Biotehnoloģija izmanto arī gēnu klonēšanu lauksaimniecībā, lai augiem un dzīvniekiem radītu jaunas īpašības vai uzlabotu esošās īpašības. Klonējot vairāk gēnu, eksponenciāli palielinās iespējamo lietojumu skaits.

DNS molekulas veido nelielu materiāla daļu dzīvā šūnā, un ir grūti izolēt daudzo gēnu ietekmi. DNS klonēšanas metodes nodrošina lielu daudzumu specifiskas DNS sekvences pētījumiem, un DNS ražo olbaltumvielas tāpat kā sākotnējā šūnā. DNS klonēšana ļauj šo darbību atsevišķi pētīt dažādiem gēniem.

Tipiski pētījumi un DNS tehnoloģiju lietojumi ietver pārbaudi:

• Gēna funkcija.
• Gēna mutācijas.
• Gēnu izpausme.
• Gēnu produkti.
• Ģenētiskie defekti.

Kad tiek klonētas vairāk DNS sekvences, ir vieglāk atrast un klonēt papildu secības. Esošos klonētos DNS segmentus var izmantot, lai noteiktu, vai jauns segments atbilst vecajam un kuras daļas atšķiras. Mērķa DNS secības noteikšana ir ātrāka un precīzāka.

In gēnu terapija, klonēts gēns tiek uzrādīts tāda organisma šūnām, kura dabiskais gēns ir bojāts. Svarīgs gēns, kas ražo olbaltumvielu, kas nepieciešams noteiktai organisma darbībai, varētu būt mutēts, mainīts ar radiāciju vai ietekmēts ar vīrusiem.

Kad gēns nedarbojas pareizi, šūnā trūkst svarīgas vielas. Gēnu terapija mēģina aizstāt gēnu ar klonētu versiju, kas ražos nepieciešamo vielu.

Gēnu terapija joprojām ir eksperimentāla, un maz pacientu ir izārstēti, izmantojot šo paņēmienu. Problēmas rodas, identificējot vienu gēnu, kas ir atbildīgs par medicīnisko stāvokli, un nogādājot daudzas gēna kopijas pareizajās šūnās. Tā kā DNS klonēšana ir kļuvusi arvien plašāka, gēnu terapija ir piemērota vairākās īpašās situācijās.

Jaunākās veiksmīgās lietojumprogrammas ir:

• Parkinsona slimība: Izmantojot vīrusu kā vektoru, pacientu vidus smadzenēs tika ievadīts ar Parkinsona slimību saistīts gēns. Pacientiem bija uzlabojusies motorika, neradot negatīvas blakusparādības.
• Adenozīna deamināzes (ADA) deficīts: Ģenētisko imūno traucējumu ārstēja, noņemot pacientu asins cilmes šūnas un ievietojot ADA gēnu. Rezultātā pacienti varēja ražot vismaz daļu no sava ADA.
• Hemofilija: Cilvēki ar hemofiliju nerada specifiskas olbaltumvielas, kas palīdz asins recēšanai. Gēns viena trūkstošā proteīna ražošanai tika ievietots pacientu aknu šūnās. Pacienti ražoja olbaltumvielas, un asiņošanas gadījumi tika samazināti.

Gēnu terapija ir viens no daudzsološākajiem DNS klonēšanas pielietojumiem, taču, visticamāk, vairosies citi jauni lietojumi, jo tiek pētīta vairāk DNS sekvences un noteikta to funkcija. DNS klonēšana piegādā gēnu inženierijas izejvielu vajadzīgajā daudzumā.

Kad gēnu loma ir zināma un to pareizu darbību var nodrošināt, nomainot defektīvos gēniem, daudzām hroniskām slimībām un pat vēzim var uzbrukt un ārstēt ģenētiskā līmenī, izmantojot DNS tehnoloģija.

Saistīts saturs:

• E. Kolija (Escherichia Coli) koloniju raksturojums
• RNS: definīcija, funkcija, struktūra