Molekulārajā bioloģijā var būt laba bufera izvēle un sagatavošanās dažādiem DNS izolācijas posmiem atšķirība starp pāreju uz olbaltumvielu ekspresiju vai cita maxi-prep komplekta atvēršanu, lai sāktu beidzies. Neskatoties uz to, ka bufera receptes ir izšķiroši svarīgas, receptes bieži vien ir tieši tās - receptes, kas rakstītas bez dažādu komponentu paskaidrojuma vai pamatojuma. Viens šāds buferis ir glikozes-tris-EDTA vai GTE buferis.
Kāpēc lieto GTE?
GTE izmanto baktēriju šūnu granulu resuspendēšanai pirms šūnu lizēšanas (atvēršanas) un plazmīdās DNS ievākšanas iekšpusē. Lizocīmu, kas mīkstina šūnu membrānas, bieži pievieno kopā ar GTE buferšķīdumu. Lai panāktu labu DNS ražu, šajā solī panākt visu šūnu homogēnu suspensiju, lai pēc tam pievienotais lizēšanas šķīdums varētu nokļūt visās šūnās. GTE ir paredzēts to izdarīt, vienlaikus nodrošinot stabilu vidi DNS.
Glikoze osmolaritātei
Lai saglabātu osmolaritāti, GTE buferšķīdumam pievieno 50 mM (milimolāru) glikozes cukuru, ja izšķīdušās vielas koncentrācija ārpus šūnām ir tuvu šūnās esošajai. Tas novērš priekšlaicīgu šūnu sabrukšanu, kas agregācijas un noārdīšanās dēļ var izraisīt zemāku DNS ražu. Arī pārējās bufera sastāvdaļas veicina šķīduma osmolaritāti, bet glikoze, tas, ka tas nav elektrolīts, ir laba izvēle, jo tas netraucē šķīduma buferi īpašības.
Tris pH stabilitātei
Tris ir īsais nosaukums tris (hidroksimetil) aminometānam, kas ir ļoti izplatīts pH buferis. GTE bufera gadījumā buferšķīdumam pievieno skābes sāli (Tris-HCl) 25 mM koncentrācijā. Tas uztur šķīduma pH gandrīz fizioloģiskā līmenī 8,0, kas ir ideāls pH, lai novērstu plazmīdās DNS skābes hidrolīzi (noārdīšanos) un citu šūnu sastāvdaļu nevēlamas blakusreakcijas.
EDTA novērš DNS noārdīšanos
EDTA jeb etilēndiamīntetraetiķskābe no šķīduma notver vai "helatē" metāla jonus, neļaujot tiem piedalīties nevēlamās blakus reakcijās. GTE buferšķīdumā EDTA pievieno 10 mM. Tās galvenais mērķis ir buferī noapaļot brīvo cinku, magniju un kalciju, tādējādi novēršot DNS noārdīšanos noteiktos ceļos, kuriem nepieciešami šie metāli.
Daži svarīgi padomi
Saglabājiet savu GTE buferi aukstu un pagatavojiet to mazos daudzumos, lai novērstu tajā neparedzētu baktēriju augšanu. Cukurs un kontrolētais pH veido lielisku augšanas vidi. Vienmēr lietojiet attīrītu ūdeni. Krāna ūdenī var būt metāla jonu pārpalikums no caurulēm, kas var pārspēt EDTA spēju notvert. Ja jums ir aizdomas, ka paraugā ir traucējoša RNS, pievienojiet RNase A 100 mikrogramiem uz mililitru GTE buferšķīdumam, lai novērstu problēmu.