Ierobežojumu fermentu avots

Kopš ierobežošanas enzīmu atklāšanas molekulārās bioloģijas joma ir strauji attīstījusies, pateicoties šo olbaltumvielu unikālajai spējai noteiktā veidā sašķelt DNS. Šie vienkāršie fermenti ir dziļi ietekmējuši pētījumus visā pasaulē; dīvainā kārtā mums ir baktērijas, kurām jāpateicas par šo zinātnisko dāvanu.

Ierobežojošie enzīmi, saukti arī par restrikcijas endonukleāzēm, saistās ar DNS un sašķeļ dubulto virkni, veidojot mazākus DNS gabalus. Ir trīs veidu restrikcijas fermenti; I tipa restrikcijas fermenti atpazīst DNS secību un nejauši sagriež virkni vairāk nekā tūkstoš bāzes pāru attālumā no vietas. II tipa restrikcijas fermenti, kas ir visnoderīgākie molekulārās bioloģijas laboratorijās, paredzami atpazīst un sagriež DNS virkni noteiktā secībā, kas parasti ir mazāka par desmit bāzes pāriem. III tipa restrikcijas fermenti ir līdzīgi I tipam, bet tie no atpazīšanas secības sagriež DNS apmēram trīsdesmit bāzes pārus.

Baktēriju sugas ir galvenais komerciālo ierobežojumu enzīmu avots. Šie fermenti kalpo, lai aizsargātu baktēriju šūnas no invāzijas ar svešu DNS, piemēram, nukleīnskābju sekvencēm, ko vīrusi izmanto, lai atkārtotu sevi saimniekšūnā. Būtībā enzīms sasmalcina DNS daudz mazākos gabaliņos, kas maz apdraud šūnu. Fermenti ir nosaukti pēc baktēriju sugas un celma, kas to ražo. Piemēram, pirmo restrikcijas fermentu, kas ekstrahēts no Escherichia coli celma RY13, sauc par EcoRI, bet piekto fermentu, kas ekstrahēts no tās pašas sugas, sauc par EcoRV.

II tipa ierobežojošo enzīmu izmantošana laboratorijās visā pasaulē ir gandrīz universāla. DNS molekulas ir ārkārtīgi garas un grūti pareizi pārvaldāmas, it īpaši, ja pētnieku interesē tikai viens vai divi gēni. Ierobežojošie enzīmi ļauj zinātniekam droši sagriezt DNS daudz mazākās daļās. Šī spēja manipulēt ar DNS ir ļāvusi virzīties uz priekšu restrikcijas kartēšanu un molekulāro klonēšanu.

Laboratorijas apstākļos ir ļoti noderīgi un ērti zināt, kur tieši DNS virknē atrodas noteiktas ierobežošanas vietas. Ja DNS sekvence ir zināma, restrikcijas kartēšanu var veikt ar datoru, kas var ātri kartēt visas iespējamās restrikcijas enzīmu atpazīšanas sekvences. Ja DNS secība nav zināma, pētnieks joprojām var izveidot vispārēju karti, izmantojot molekulas šķelšanai dažādus fermentus paši un kopā ar citiem enzīmiem. Izmantojot deduktīvo argumentāciju, var izveidot vispārējo ierobežojumu karti. Pieejama ierobežojumu karte ir kritiska, klonējot gēnus.

Molekulārā klonēšana ir laboratorijas paņēmiens, kurā gēnu no mērķa DNS molekulas, kas parasti tiek iegūts no organisma, sagriež ar restrikcijas enzīmiem. Pēc tam gēns tiek ievietots molekulā, ko sauc par vektoru, kas parasti ir mazi gabali cirkulārā DNS, ko sauc par plazmīdām un kas ir modificēta, lai pārvadātu vairākus restrikcijas enzīma mērķus secības. Vektors tiek atvērts ar restrikcijas enzīmu palīdzību, un pēc tam gēns tiek ievietots apļveida DNS. Ferments, ko sauc par DNS ligāzi, pēc tam var pārveidot loku, iekļaujot tajā mērķa gēnu. Kad gēns ir šādi “klonēts”, vektoru var ievietot baktēriju šūnā, lai gēns varētu ražot olbaltumvielas.