Tris jeb tris (hidroksimetil) aminometāns ir izplatīts bioloģiskais buferis, ko izmanto visā DNS ekstrakcijas procesā. Ekstrakcijas laikā no jebkura skaita avotiem DNS ir jutīga pret pH. Šūnu lizēšanas, nevēlamu šūnu sastāvdaļu noņemšanas un nogulsnēšanās laikā tris lieto stabilā pH uzturēšanai. Turklāt tam ir īpaši svarīga loma šūnu sabrukšanā.
TL; DR (pārāk ilgi; Nelasīju)
DNS ekstrakcija ir uz pH jutīgs process, un tris bufera izmantošana palīdz uzturēt pH stabilitāti attiecībā uz šūnu lizēšanu un ekstrakciju.
Triss kā buferis
Tā kā pH var ietekmēt un ietekmēt vairāki šūnu faktori, eksperimentālajai zinātnei ir svarīgi uzturēt stabilu pH līmeni. Bioloģiskie buferi, tāpat kā tris, ir svarīgi, jo tie var uzturēt stabilu pH līmeni, neskatoties uz ietekmi, kas citādi varētu mainīt pH līmeni. Tris (hidroksimetil) aminometāns ar pKa 8,1 ir efektīvs buferšķīdums starp pH 7 un 9. Neitrālā diapazona dēļ tris ir bioloģiskās laboratorijās parasti izmantots buferis. Tomēr, lai izvairītos no neprecizitātēm, tris buferšķīdums ir jutīgs pret temperatūru, un tas jāizmanto temperatūrā, kurā tas sākotnēji tika pH.
Šūnu lizēšana
Līze jeb šūnu atvēršana ir pirmais DNS ekstrakcijas posms. To panāk ar buferšķīdumu, kas satur tris un EDTA (etilēndiamīntetraetiķskābi). EDTA saista divvērtīgus katjonus, piemēram, kalciju un magniju. Tā kā šie joni palīdz saglabāt šūnu membrānas integritāti, to izvadīšana ar EDTA destabilizē membrānu. Tris ir galvenā buferizācijas sastāvdaļa; tā galvenā loma ir bufera pH uzturēšana stabilā punktā, parasti 8,0. Turklāt tris iespējams, mijiedarbojas ar membrānā esošo LPS (lipopolisaharīdu), kalpojot membrānas destabilizācijai tālāk.
Tris aizsargā DNS no pH izmaiņām
Kad šūnas ir sadalītas, to DNS un saturs izlīst buferī. Turklāt bieži tiek iekļauta RNāze A (iznīcina RNS), proteāzes (iznīcina olbaltumvielas) un SDS (nātrija dodecilsulfāts, kas izšķīdina membrānas fragmentus). Kopumā šī šūnu satura un sadrumstalota RNS un olbaltumvielu zupa var ļoti ietekmēt šķīduma pH. Tā kā DNS ir jutīga pret pH, tris ir svarīgi buferēt zupu un uzturēt pH nemainīgu.
DNS nokrišņi
DNS ekstrakcijas pēdējā posmā no šķīduma tiek iegūta pati DNS. Šajā brīdī DNS ir šķīst buferī. Lai ekstrahētu no šķīduma, DNS padara nešķīstošu, pievienojot etanolu vai izopropanolu (izopropilspirtu). Kad tas ir izdarīts, DNS šķīdumā kļūst acīmredzama kā balta viela. Kaut arī šādā veidā DNS var izolēt no atlikušajiem šūnu komponentiem, tas nav "lietojams", ja tas ir nešķīstošs. Pēc izolēšanas spirts tiek noņemts, un DNS ir jāatgriež bioloģiskajā buferšķīdumā, piemēram, tris, lai to izmantotu.
Dari pats
Lai gan DNS ieguve parasti tiek veikta pētniecības laboratorijās, parasti izmantojot vienu no vairākiem komerciāli pieejamie komplekti ikviens var veikt DNS iegūšanu mājās, izmantojot parastos sadzīves priekšmetus un zaļo zirņi vai spināti. Šajā gadījumā, lai pasargātu DNS no pH izmaiņām, nav tris, kā arī neviena bioloģiskā bufera. Tomēr tas ir vizuāls veids, kā palīdzēt studentiem izveidot savienojumu ar šūnu DNS.
