Kā tiek savākts un sagatavots pētījumam DNS paraugs

Pirms viņi var secināt DNS vai mainīt to, izmantojot gēnu inženieriju, zinātniekiem tā vispirms jāizolē. Tas varētu šķist grūts uzdevums, jo šūnas satur daudz dažādu citu savienojumu, piemēram, olbaltumvielas, taukus, cukurus un mazas molekulas. Par laimi, biologi var izmantot DNS ķīmiskās īpašības, lai nošķirtu DNS no šiem piesārņotājiem un sagatavotu to turpmākiem pētījumiem. Šo procesu sauc par DNS ekstrakciju.

DNS ekstrakcijai tiek izmantotas daudzas dažādas metodes. Individuālās laboratorijas izmantotais ir atkarīgs no veicamā eksperimenta veida un DNS tīrības pakāpes. Zinātnieki parasti sāk ar paraugu, kurā ir šūnas - piemēram, audu vai asins paraugs, un šūnas pārrauj vai lizē. Šūnas var lizēt dažādos veidos. Pievienojot mazgāšanas līdzekli, tie atdalīsies, tāpat kā pakļaujot tos augstfrekvences skaņas viļņiem. Alternatīvi, sajaucot paraugu ar stikla lodītēm un ātri to vibrējot, fiziski sadalīsies šūnas un izdalīsies to saturs.

Ja augsta tīrība nav nepieciešama, zinātnieki var pievienot fermentu, ko sauc par proteināzi K, lai sadalītu lielāko daļu olbaltumvielu paraugā, pēc tam izmantot to tādu, kāds tas ir. Šī tehnika tomēr ir ļoti netīra, jo lielākā daļa piesārņotāju joprojām atrodas, tāpēc tā ir piemērota tikai tad, ja ātrums ir prioritāte un tīrība nav problēma. Vēl viena ātra un netīra pieeja ir olbaltumvielu noņemšana, palielinot sāls koncentrāciju, pievienojot tādus sāļus kā amonijs vai kālija acetāts, lai piespiestu olbaltumvielas nogulsnēties. Arī šī tehnika ir diezgan netīra, jo joprojām ir daudz citu piesārņotāju.

Vēl viena pieeja ir šūnu lizēšana ar mazgāšanas līdzekli, pēc tam šķīduma sajaukšana ar izoamilspirtu, hloroformu un fenolu. Pēc tam šķīdums sadalās divos slāņos. Olbaltumvielas nonāk augšējā organiskajā slānī, bet DNS paliek apakšējā ūdens slānī. Lai iegūtu labus rezultātus, šī metode prasa rūpīgu sāls koncentrācijas un pH kontroli. Tas prasa daudz laika, un gan fenols, gan hloroforms ir ļoti toksiskas ķīmiskas vielas. Līdz ar to, kaut arī fenola-hloroforma ekstrakcija kādreiz bija ikdiena, pēdējos gados citas metodes ir kļuvušas populārākas.

Anjonu apmaiņas hromatogrāfija piedāvā augstāku tīrību un konsekventākus rezultātus nekā ekstrakcija ar fenola-hloroformi. Caurule vai kolonna ir pildīta ar mazām daļiņām, uz kurām ir pozitīvi uzlādētas vietas, kur var saistīties negatīvi lādēta molekula vai anjons. DNS saistās ar šīm anjonu apmaiņas vietām, kamēr citi piesārņotāji, piemēram, olbaltumvielas un RNS, tiek izskaloti no kolonnas. Vēlāk, lai izvilktu DNS no kolonnas, izmanto ar sāli bagātu šķīdumu.

Ātrākais un, iespējams, uzticamākais paņēmiens DNS attīrīšanai ir speciāli izgatavota komplekta izmantošana. Šie komplekti satur silikagēla membrānas mēģenē. DNS pielīp pie membrānas, kamēr citi piesārņotāji tiek izskaloti, izmantojot virkni speciāli sagatavotu sāls šķīdumu, kas nāk komplektā. Visbeidzot, DNS no kolonnas nomazgā ar sāls šķīdumu. Šie komplekti ir ātri, ērti lietojami un piedāvā atkārtojamus rezultātus.

Kad DNS ir izolēts un atkārtoti suspendēts pH kontrolētā buferšķīdumā, pēdējais posms ir tā tīrības pārbaude. Vienkāršs un ērts veids, kā to izdarīt, ir pārbaudīt, cik daudz ultravioletās gaismas tas absorbē pie 260 un 280 nanometru viļņu garumiem. Absorbcijai pie 260 nanometriem dalot ar absorbciju pie 280 nanometriem, jābūt vienādai ar 1,8, ja DNS ir tīra. Absorbcijas mērīšana pie 260 nanometriem ļauj arī noteikt DNS koncentrāciju.