Kā tiek vizualizēta DNS, izmantojot gēla elektroforēzi?

Gēla elektroforēze ir paņēmiens, kas ļauj analizēt DNS tā sastāvā esošo molekulu līmenī. Šajā DNS vizualizācijas metodē paraugi tiek novietoti uz agarozes gēla barotnes un uz gela tiek uzklāts elektriskais lauks. Tas izraisa DNS fragmentu migrāciju caur gēlu dažādos ātrumos atbilstoši to elektroķīmiskajām īpašībām.

Etidija bromīds

Šajā vizualizācijas tehnikā etīdija bromīdu sajauc ar agarozes pulveri, EDTA buferšķīdumu un ūdeni, lai pirms elektroforēzes izveidotu gēla matricu. Tā rezultātā etīdija bromīda molekulas vienmērīgi izkliedējas visā matricā. Kad želejas iedobes ir piepildītas ar attiecīgajiem DNS paraugiem un izsekošanas krāsvielām, tiek piemērots spriegums, lai lēnām lielos, polāros savienojumus novilktu pa matricu.

Šīs kustības laikā DNS molekulu bāzes īslaicīgi saistās ar daļiņām, pateicoties etidija bromīda lādiņam, velkot tās līdzi. Kad gēla elektroforēze ir pabeigta, katra DNS molekula ir uzņemusi ievērojamu daudzumu etidija bromīda.

Ultravioletās gaismas klātbūtnē etīdija bromīds uzrāda fluorescenci. Tehniķi spīd īpaši kalibrētu UV gaismu visā gēlā, kamēr mašīna uztver mirdzošo fragmentu attēlu.

instagram story viewer

Metilēnzils

Ja UV staru apgaismotājs nav pieejams vai praktisks, tehniķi var padarīt DNS redzamu normālos apstākļos gatavo agarozes gēlu ar elektroforizētu DNS iekšpusē iemērcot metilēnzilā šķīdumā uz nakti.

Hlorīda sāls ar ievērojami hidrofobu anjonu, metilēnzilās molekulas iekļūst visā gēla matricā. Tomēr ūdeņraža savienojums visā DNS izraisa traipu molekulu uzkrāšanos. Šis palielinātais DNS traipu blīvums rada dziļāku zilu nokrāsu, kas redzama ar neapbruņotu aci.

Krāsvielu izsekošana

Papildus DNS joslu relatīvajam lielumam tehniķi var izmērīt katra fragmenta absolūto izmēru (bāzes pāros), izmantojot ķīmiskas vielas, ko sauc par izsekošanas krāsvielām. Redzams bez metilēnzilā vai etidija bromīda pievienošanas, izsekošanas krāsas, piemēram, bromfenola zils un ksilola cianols, pārvietojas pa aragozes gela matricas elektroforēzes laikā ar tādu pašu ātrumu kā DNS fragmenti, kas sastāv no 300 nukleotīdiem un 4000 nukleotīdiem, attiecīgi. Elektroforēzē masīvāki DNS fragmenti pāri gēla matricai pārvietojas lēnāk nekā mazāki fragmenti. Tāpēc, lai gan izsekošanas krāsvielas tieši neietekmē DNS fragmentu redzamību, salīdzinot DNS fragmentu stāvokli gēlā līdz šo krāsvielu stāvoklim ļauj tehniķiem "redzēt" aptuveno DNS fragmenta nukleotīdu skaitu satur.

Teachs.ru
  • Dalīties
instagram viewer