Strādājot ar augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfiju (HPLC), laba kalibrēšana ir absolūti nepieciešama, lai nodrošinātu uzticamus un kvalitatīvus rezultātus. Pareiza HPLC instrumenta kalibrēšana sākas ar piemērota kalibrēšanas standarta izgatavošanu. Vairumā gadījumu kalibrēšanai ir vajadzīgi vairāki standarti ar pieaugošu koncentrāciju, lai izveidotu tā dēvēto kalibrēšanas līkni. Šī ir uzzīmēta līnija un saistītais vienādojums, kas apraksta saistību starp pārbaudāmās ķīmiskās vielas koncentrāciju un HPLC detektora reakciju.
Nosakiet ķīmisko vielu, kuru vēlaties pārbaudīt, izmantojot HPLC ("analizējamo vielu"). Piemēram, jūs varētu vēlēties pārbaudīt virkni bezalkoholisko dzērienu attiecībā uz fruktozes saturu, tādā gadījumā fruktoze būtu analizējamā viela.
Iegūst piemērotas tīrības pakāpi analizējamās ķīmiskās vielas daudzumam. Parasti tīrībai jābūt virs 99%, un analizējamais materiāls jāiegādājas cienījamā ķīmisko vielu piegādes uzņēmumā. Piemēram, fruktozes gadījumā tīru fruktozi iegādātos no ķīmijas preču pārdevēja, nevis no pārtikas preču veikala.
Nosakiet maksimālo un minimālo paredzamo analīta koncentrāciju paraugos, kurus plānojat testēt ar HPLC. Bezalkoholisko dzērienu gadījumā pārbaudiet dzērienu etiķetes un noteiksit zemāko un augstāko fruktozes saturu starp pārbaudāmajiem dzērieniem. Paturiet prātā, ka sākotnējo paraugu (bezalkoholisko dzērienu) analīzes sagatavošanas laikā var atšķaidīt vai kā citādi manipulēt (atkarībā no izmantotās HPLC metodes) un līdz ar to analizējamo vielu koncentrācija paraugos, kas faktiski ievadīti HPLC, var būt modificēts. Jāņem vērā analizējamās vielas koncentrācija paraugos, kas veikti ar HPLC.
Lai izveidotu kalibrēšanas standartus, nosakiet šķīdinātāju, kurā izšķīdināsiet analizējamo vielu. Šim šķīdinātājam jāspēj pienācīgi izšķīdināt analizējamo vielu samērā plašā koncentrācijas diapazonā (vismaz tikpat lielā mērā kā paraugos, kurus plānojat pārbaudīt). Tāpat ideālā gadījumā šim šķīdinātājam vajadzētu būt diezgan līdzīgam "kustīgajai fāzei": šķīdinātājam, ko izmanto paraugu pārvadāšanai caur HPLC instrumentu.
Aprēķina analizējamās vielas daudzumu, kas nepieciešams, lai pagatavotu analizējamā materiāla "standarta standartšķīdumu". To iegūst, reizinot nepieciešamo krājuma standarta koncentrāciju ar vēlamo tilpumu. Analīta koncentrācijai šajā šķīdumā jābūt vismaz par 10% lielākai par augstāko paredzamo parauga koncentrāciju. Ja lielākā paredzamā fruktozes koncentrācija bezalkoholisko dzērienu paraugā ir 8 grami / 100 mililitri, tad izejvielu standartu var noteikt līdz 10 gramiem fruktozes / 100 mililitriem. Saprātīgs tilpums ir 500 mililitri, tāpēc būtu nepieciešami 8/100 ml x 500 ml = 40 grami fruktozes.
Nosver nepieciešamo analizējamās vielas daudzumu ar piemērotu precizitāti. Bieži vien svara vērtība gramos, kas precīzi norādīta ar vienu vai diviem cipariem aiz komata, ir piemērota, taču dažām metodēm var būt nepieciešama lielāka precizitāte.
Nosvērto analizējamo vielu pārnes vajadzīgā tilpuma mērkolbā un pievieno vajadzīgo šķīdinātāju kolbas uzpildes atzīmei. Mērkolbas (nevis, piemēram, mērglāzes) izmantošana palielina krājuma standarta koncentrācijas vērtības precizitāti. Nodrošina, ka visa analizējamā viela tiek pārnesta uz kolbu; ja nepieciešams, izmantojiet nedaudz šķīdinātāja, lai to nomazgātu.
Izgatavo dažādu izejvielu standarta atšķaidījumu sēriju, pārnesot zināmos izejas standarta tilpumus mērkolbās, precīzai pārnešanai izmantojot pipetes, pēc tam pievienojot šķīdinātāju. Zemākajai standartkoncentrācijai jābūt zemākai par zemāko paredzamo analizējamo paraugu. Bezalkoholisko dzērienu piemērā, ja zemākā paredzamā fruktozes koncentrācija paraugā ir 2 grami / 100 ml, tad var noteikt 1 grama / 100 ml standartu. To panāktu, akciju standartu atšķaidot desmitkārtīgi. Standarta sērijā kopumā jāiekļauj 5 vai 6 koncentrācijas, tāpēc būtu nepieciešami papildu atšķaidījumi, lai iegūtu standartus, kuru fruktoze / ml varētu būt 3, 5 un 8 grami / ml. Tagad jums ir virkne standarta risinājumu, ar kuriem kalibrēt HPLC.
