Polimerazės grandininė reakcija arba PGR yra metodas, kuris vieną DNR fragmentą nukopijuoja į daug fragmentų - eksponentiškai daug. Pirmasis žingsnis yra PGR - tai DNR pašildymas taip, kad ji denatūruotų arba ištirptų į atskiras sruogas. DNR struktūra yra tarsi lynų kopėčios, kuriose pakopos yra lynai su magnetiniais galais. Magnetai jungiasi, kad suformuotų laiptelius, vadinamus pagrindo poromis, ir taip priešinasi, kad būtų ištraukti. Kiekvienas DNR fragmentas, esant skirtingai temperatūrai, ištirpsta atskirose grandinėse. Supratimas, kaip DNR struktūrą laiko atskiros DNR dalys, leis suprasti, kodėl skirtingi DNR fragmentai tirpsta esant skirtingoms temperatūroms ir kodėl pirmoje reikia tokios aukštos temperatūros vieta.
Tirpsta! Tirpsta!
Pirmasis PGR žingsnis yra ištirpinti DNR, kad dvigubos grandinės DNR atsiskirtų į viengrandę DNR. Žinduolių DNR atveju šis pirmasis žingsnis paprastai apima maždaug 95 laipsnių Celsijaus (apie 200 Fahrenheito) šilumą. Esant tokiai temperatūrai, vandenilio ryšiai tarp A-T ir G-C bazių porų arba DNR kopėčių laipteliai suyra, atsegdami dvigubos grandinės DNR. Tačiau temperatūra nėra pakankamai karšta, kad nulaužtų fosfatų ir cukraus pagrindą, kuris sudaro pavienes sruogas arba kopėčių ašis. Visiškas atskirų sruogų atskyrimas paruošia juos antram PGR žingsniui, kuris vėsina, kad trumpi DNR fragmentai, vadinami pradmenimis, sujungtų atskiras sruogas.
Magnetiniai užtrauktukai
Viena iš priežasčių, kodėl DNR kaitinama iki aukštos 95 laipsnių Celsijaus temperatūros, yra ta, kad kuo ilgesnė DNR dviguba grandinė, tuo labiau ji nori likti kartu. DNR ilgis yra vienas veiksnys, turintis įtakos tirpimo taškui, pasirinktam PGR ant tos DNR dalies. AT ir G-C bazių poros dvigubos grandinės DNR jungiasi viena su kita, kad kartu laikytų dvigubos grandinės struktūrą. Kuo daugiau vienas po kito einančių bazinių porų susirišo dvi viengrandės, tuo labiau jų kaimynai taip pat nori susirišti, ir tuo stipresnė trauka tarp dviejų sruogų tampa. Tai tarsi užtrauktukas iš mažų magnetukų. Uždarius užtrauktuką, magnetai natūraliai norės užsitraukti ir likti užtrauktuku.
Stipresni magnetai laikosi tvirtiau
Kitas veiksnys, turintis įtakos tiriamai DNR fragmento lydymosi temperatūrai, yra tame fragmente esančių G-C bazių porų kiekis. Kiekviena bazinė pora yra tarsi du mini magnetai, kurie traukia. Pora, pagaminta iš G ir C, yra daug labiau pritraukta nei A ir T pora. Taigi DNR gabalui, turinčiam daugiau G-C porų nei kitam fragmentui, prieš ištirpstant į atskiras grandines, reikės aukštesnės temperatūros. DNR natūraliai sugeria ultravioletinę šviesą - tiksliau - 260 nanometrų bangos ilgį, o vienos grandinės DNR sugeria daugiau šviesos nei dvigubos grandinės DNR. Taigi, matuojant sugertos šviesos kiekį, galima išmatuoti, kiek jūsų dviejų gijų DNR ištirpo į pavienes sruogas. G-C ir A-T bazinių porų „magnetinio užtrauktuko“ poveikis sukelia šviesos absorbcijos grafiką. dvigubos grandinės DNR, kai temperatūra pakyla, yra sigmoidinė, formos S, o ne a tiesi linija. S kreivė rodo komandinio darbo pasipriešinimą, kurį pagrindinės poros daro prieš šilumą, nes jos nenori atskirti.
Pusiaukelė
Temperatūra, kai DNR ilgis ištirpsta atskirose grandinėse, vadinama jos lydymosi temperatūra, kuri žymima santrumpa „Tm“. Tai rodo temperatūrą, kurioje pusė tirpale esančios DNR ištirpo į viengijas, o kita pusė vis dar yra dvigubos grandinės forma. Kiekvieno DNR fragmento lydymosi temperatūra yra skirtinga. Žinduolių DNR G-C kiekis yra 40%, o tai reiškia, kad likę 60% bazinių porų yra As ir Ts. Dėl jo 40% G-C kiekio žinduolių DNR tirpsta 87 laipsnių Celsijaus (apie 189 Farenheito) temperatūroje. Štai kodėl pirmasis žinduolių DNR PGR žingsnis yra jos pašildymas iki 94 laipsnių Celsijaus (201 Fahrenheito). Vos septyniais laipsniais karštesnė už lydymosi temperatūrą, o visos dvigubos sruogos visiškai ištirps iki vijų.