Kai reikia išmatuoti DNR fragmentų ilgį, kuris yra daug mažesnis nei ląstelės, mikrobiologams reikia apgauti, o patogiausia - elektroforezė geliu. Šis metodas remiasi tuo, kad DNR fragmentai yra įkrauti, ir tai yra alternatyva brangesnėms metodai, tokie kaip rentgeno kristalografija, kuri buvo atsakinga už dvigubos spiralės struktūros atradimą DNR.
Kaip veikia gelio elektroforezė
Kadangi DNR molekulės yra įkraunamos, jas veikia elektros srovė. Kai nustatysite juos į neutralų gelį ir padėsite srovę per gelį, molekulės migruos link teigiamojo elektrodo (anodo). Kadangi skirtingo dydžio DNR molekulės turi tą patį krūvį, mažesnės keliauja greičiau, todėl šis procesas išskiria molekules į juostas, kurias galima palyginti su žinomo dydžio mėginiais.
Pagrindinė elektroforezės procedūra
Gelis paprastai gaminamas iš agarozės - polisacharido, kuris kaitinamas buferiniame tirpale sudaro pusiau kietą, šiek tiek porėtą gelį. Viename gale gelis suformuoja mažus įdubimus, vadinamus duobutėmis, kur tyrėjas įdeda tiriamus DNR mėginius kartu su žinomo ilgio etaloniniais mėginiais, vadinamais DNR kopėčiomis. Kopėčių fragmentų ilgiai buvo iš anksto nustatyti kitu metodu, pavyzdžiui, rentgeno kristalografija.
Kai gelis panardinamas į laidųjį tirpalą ir įjungiama įtampa, fragmentai pradeda migruoti per gelį - pirmiausia mažesni ir didesni, lėtesni. Pagaliau jie pagal dydį suformuoja save į spektrą panašias juostas.
Kai tai atsitiks, tyrėjas išjungia maitinimą, įlašina gelį su DVA surišančiu dažikliu ir tiria mėginius ultravioletinėje šviesoje. Naudodamas kopėčias kaip atskaitos tašką, tyrėjas gali nustatyti kiekvieno fragmento dydį matomoje juostoje. Matomos tik juostos - atskiri DNR fragmentai yra per maži, kad juos būtų galima pamatyti.
Nežinomų fragmentų ilgių nustatymas
Tikimybė, kad ne kiekviena mėginio juosta poruojasi su juosta ant kopėčių, todėl mokslininkai, norėdami nustatyti šių nežinomų fragmentų dydžius, dažniausiai nubraižo grafiką. X ašyje yra atstumas, kurį kiekviena juosta kopėčiose nuvažiuoja milimetrais, o y ašyje - kiekvienos juostos dydis. Kai taškus sujungia kreivė, bet kurios juostos dydį galima ekstrapoliuoti iš kreivės, milimetrais matavus tos juostos nueitą atstumą.