Molekulinėje biologijoje gali būti geras buferio pasirinkimas ir paruošimas įvairiems DNR išskyrimo etapams skirtumas tarp perėjimo prie baltymų ekspresijos ar atidarymo kitam maxi-prep rinkiniui pradėti baigėsi. Nepaisant lemiamos svarbos, buferiniai receptai dažnai yra būtent tokie - receptai parašyti be paaiškinimo ar skirtingų komponentų pagrindimo. Vienas iš tokių buferių yra gliukozės-tris-EDTA arba GTE buferis.
Kam naudojamas GTE?
GTE naudojamas bakterijų ląstelių granulėms pakartotinai suspenduoti prieš lizuojant (atidarant) ląsteles ir renkant plazmidės DNR viduje. Lizocimas, minkštinantis ląstelių membranas, dažnai pridedamas kartu su GTE buferiu. Norint gauti gerą DNR kiekį, šiame etape reikia pasiekti homogenišką visų ląstelių suspensiją, kad vėliau pridėtas lizės tirpalas patektų į visas ląsteles. GTE yra sukurtas tai padaryti, kartu užtikrinant stabilią aplinką DNR.
Gliukozė dėl osmoliškumo
Norint išlaikyti osmoliškumą, ten, kur ištirpusios medžiagos koncentracija už ląstelių ribų yra artima koncentracijai ląstelių viduje, į GTE buferį pridedama 50 mM (milimoliarinio) gliukozės cukraus. Tai užkerta kelią ankstyvai ląstelių lizei, kuri dėl agregacijos ir skaidymo gali sukelti mažesnį DNR kiekį. Kiti buferio komponentai taip pat prisideda prie tirpalo osmoliškumo, tačiau gliukozė, būti ne elektrolitu yra geras pasirinkimas, nes tai netrukdo tirpalo buferiui savybes.
Tris pH stabilumui
Tris yra trumpasis tris (hidroksimetil) aminometano pavadinimas, kuris yra labai paplitęs pH buferis. GTE buferio atveju į buferį pridedama 25 mM koncentracijos rūgšties druska (Tris-HCl). Tai palaiko tirpalo pH beveik fiziologiniu lygiu 8,0, idealų pH, kad būtų išvengta plazmidės DNR rūgšties hidrolizės (degradacijos) ir nepageidaujamų kitų ląstelių komponentų šalutinių reakcijų.
EDTA apsaugo nuo DNR skaidymo
EDTA arba etilendiamintetraacto rūgštis sulaiko arba „cheluoja“ metalo jonus iš tirpalo, neleisdama jiems dalyvauti nepageidaujamose šalutinėse reakcijose. Į GTE buferį EDTA pridedama 10 mM. Pagrindinis jo tikslas yra buferis suapvalinti laisvąjį cinką, magnį ir kalcį, tokiu būdu užkertant kelią DNR degradacijai tam tikrais būdais, kuriems reikalingi tie metalai.
Keletas svarbių patarimų
Laikykite GTE buferį šaltą ir gaminkite nedideliais kiekiais, kad išvengtumėte jame nenumatytų bakterijų. Cukrus ir kontroliuojamas pH yra puiki auginimo terpė. Visada naudokite išgrynintą vandenį. Vandenyje iš čiaupo gali būti metalų jonų perteklius iš vamzdžių, o tai gali užgožti EDTA gebėjimą sugauti. Jei įtariate, kad jūsų mėginyje yra trukdančios RNR, į GTE buferį įpilkite RNazės A 100 mikrogramų mililitre, kad pašalintumėte problemą.