Molekulinis klonavimas yra įprastas biotechnologijų metodas, kurį turėtų žinoti kiekvienas studentas ir tyrėjas. Molekulinis klonavimas naudojant fermentą, vadinamą restrikcijos fermentu, žmogaus DNR supjaustyti fragmentais, kuriuos vėliau galima įterpti į bakterijų ląstelės plazmidinę DNR. Ribojimo fermentai perpjauna dvigubas DNR per pusę. Priklausomai nuo restrikcijos fermento, pjūvis gali sukelti lipnų arba buką galą. Lipni galai yra naudingesni atliekant molekulinį klonavimą, nes jie užtikrina žmogaus DNR fragmento įterpimą į plazmidę teisinga kryptimi. Susiejimo procesui arba DNR fragmentų suliejimui reikia mažiau DNR, kai DNR turi lipnius galus. Galiausiai, daugybė lipnių galų restrikcijos fermentų gali pagaminti tą patį lipnųjį galą, nors kiekvienas fermentas atpažįsta skirtingą restrikcijos seką. Tai padidina tikimybę, kad jūsų norimą DNR sritį gali išpjauti lipnūs galiniai fermentai.
Apribojimų fermentai ir apribojimų svetainės
Ribojantys fermentai yra fermentai, kurie supjausto atpažįsta specifines dvigubos grandinės DNR sekas ir perduoda DNR per tą seką. Atpažinta seka vadinama restrikcijos vieta. Ribojantys fermentai vadinami endonukleazėmis, nes jie perpjauna dvigubas DNR, būtent DNR paprastai egzistuoja, tose vietose, kurios yra tarp DNR galų. Yra daugiau nei 90 skirtingų restrikcijos fermentų. Kiekvienas atpažįsta atskirą ribojimo vietą. Ribojimo fermentai skaido savo atitinkamas restrikcijos vietas 5000 kartų efektyviau nei kitos vietos, kurių jie neatpažįsta.
Teisinga orientacija
Ribojimo fermentai skirstomi į dvi bendras klases. Jie arba supjausto DNR lipniais, arba bukais galais. Lipni galas turi trumpą nukleotidų sritį - DNR statybinius elementus, kurie nėra suporuoti. Šis neporinis regionas vadinamas perdanga. Teigiama, kad perdanga yra lipni, nes ji nori ir derės su kita lipnia gale, kuri turi papildomą perdangos seką. Lipni galai yra tarsi seniai pamesti dvyniai, kurie susitikę siekia stipriai apkabinti vienas kitą. Kita vertus, buki galai nėra lipnūs, nes visi nukleotidai jau yra suporuoti tarp dviejų DNR grandinių. Lipnių galų privalumas yra tas, kad žmogaus DNR fragmentas gali tilpti į bakterijų plazmidę tik viena kryptimi. Priešingai, jei tiek žmogaus DNR, tiek bakterijų plazmidės galai yra bukai, žmogaus DNR į plazmidę galima įterpti nuo galvos iki uodegos arba iš uodegos į galvą.
Lyginant lipnius galus, reikia mažiau DNR
Nors DNR su lazdelės galais yra lengviau surasti vienas kitą dėl jų „lipnumo“, nei lipnūs, nei buki galai negali susilieti į ištisinį DNR gabalą. Norint susidaryti ištisai susietai DNR daliai, kuri yra visiškai susieta, reikalingas fermentas, vadinamas ligaze. Ligazės sujungia nukleotidų stuburus lipniuose ar bukuose galuose, todėl susidaro ištisinė nukleotidų grandinė. Kadangi lipnūs galai greičiau atranda vienas kitą dėl jų traukos vienas kitam, perrišimo procesui reikia mažiau žmogaus DNR ir mažiau plazmidės DNR. Mažesni tikimybės, kad DNR ir plazmidžių galai suras vienas kitą, todėl norint surišti bukus galus, į mėgintuvėlį reikia įdėti daugiau DNR.
Skirtingi fermentai gali suteikti tą pačią lipnią galą
Ribojimo vietos yra visame organizmų genome, tačiau nėra tolygiai išdėstytos. Plazmidėse jie gali būti sukonstruoti taip, kad būtų išdėstyti vienas šalia kito. Mokslininkai, norintys iš žmogaus genomo iškirpti žmogaus DNR fragmentą, turi rasti restrikcijos vietas, esančias priešais ir galus fragmento srityje. Be to, kad skirtingi lipnių galų fermentai užtikrina, kad DNR fragmentas būtų įterpiamas teisinga kryptimi, jie gali sukurti tą patį lipnų galą, net jei jie atpažįsta skirtingas restrikcijos sekas. Pavyzdžiui, „BamHI“, „BglII“ ir „Sau3A“ turi skirtingas atpažinimo sekas, tačiau gamina tą patį GATC lipnų galą. Tai padidina tikimybę, kad atsiras lipnių galo ribojimo vietų, kurios palies jūsų dominantį žmogaus geną.