Prieš sekdami DNR ar keisdami genų inžineriją, mokslininkai pirmiausia turi ją izoliuoti. Tai gali atrodyti sunki užduotis, nes ląstelėse yra daugybė kitų junginių, tokių kaip baltymai, riebalai, cukrus ir mažos molekulės. Laimei, biologai gali panaudoti DNR chemines savybes norėdami atskirti DNR nuo šių teršalų ir paruošti tolesniems tyrimams. Šis procesas vadinamas DNR išskyrimu.
Ląstelių lizė
DNR išskyrimui naudojama daugybė skirtingų metodų. Eksperimentas, kurį naudoja individuali laboratorija, priklauso nuo atliekamo eksperimento tipo ir nuo to, kiek gryna turi būti DNR. Mokslininkai paprastai imasi mėginio, kuriame yra ląstelių - pavyzdžiui, audinio ar kraujo mėginio, ir pertraukia ląsteles arba jas lizuoja. Lizes galite lizuoti įvairiais būdais. Pridėjus ploviklio, jie išsiskirs, taip pat patirs aukšto dažnio garso bangas. Arba sumaišius mėginį su stiklo karoliukais ir greitai jį vibravus, fiziškai suskaidomos ląstelės ir išsiskiria jų turinys.
Greitas ir purvinas požiūris
Jei didelio grynumo nereikia, mokslininkai gali pridėti fermentą, vadinamą proteinaze K, kad suskaidytų daugumą baltymų mėginyje, tada naudokite jį tokį, koks yra. Tačiau ši technika yra labai nešvari, nes vis dar yra teršalų, todėl ji tinka tik tuo atveju, jei greitis yra prioritetas ir grynumas nėra problema. Kitas greitas ir nešvarus būdas yra pašalinti baltymus padidinant druskos koncentraciją pridedant tokių druskų kaip amonio ar kalio acetato, kad priverstų baltymus nusodinti. Ši technika taip pat yra gana nešvari, nes vis dar yra daug kitų teršalų.
Fenolio ir chloroformo ekstrahavimas
Kitas būdas yra lizuoti ląsteles plovikliu, tada tirpalą sumaišyti su izoamilo alkoholiu, chloroformu ir fenoliu. Tada tirpalas išsiskiria į du sluoksnius. Baltymai patenka į viršutinį organinį sluoksnį, o DNR lieka apatiniame vandeniniame sluoksnyje. Norint pasiekti gerų rezultatų, reikia kruopščiai kontroliuoti druskos koncentraciją ir pH. Tai užima daug laiko, ir fenolis, ir chloroformas yra labai toksiškos cheminės medžiagos. Taigi, nors fenolio ir chloroformo ekstrakcija kadaise buvo įprasta, pastaraisiais metais kiti metodai išpopuliarėjo.
Anijonų mainų chromatografija
Anijonų mainų chromatografija suteikia didesnį grynumą ir nuoseklesnius rezultatus nei ekstrahavimas fenolis-chloroformas. Vamzdis ar kolonėlė yra supakuota su mažomis dalelėmis, kuriose yra teigiamai įkrautų vietų, kur gali susijungti neigiamai įkrauta molekulė ar anijonas. DNR prisijungia prie šių anijonų mainų vietų, o kiti teršalai, pavyzdžiui, baltymai ir RNR, nuplaunami nuo kolonos. Vėliau tirpalas, kuriame yra daug druskos, naudojamas ištraukti DNR iš kolonos.
Rinkiniai
Greičiausia ir galbūt patikimiausia DNR gryninimo technika yra specialiai pagaminto rinkinio naudojimas. Šiuose rinkiniuose vamzdyje yra silikagelio membranų. DNR prilimpa prie membranos, o kiti teršalai nuplaunami naudojant specialiai paruoštų druskos tirpalų seriją, gautą kartu su rinkiniu. Galiausiai DNR iš kolonos nuplaunama mažai druskos turinčiu tirpalu. Šie rinkiniai yra greiti, patogūs naudoti ir suteikia pakartojamų rezultatų.
Absorbcija
Kai DNR bus išskirta ir pakartotinai suspenduota pH kontroliuojamame buferiniame tirpale, paskutinis žingsnis yra patikrinti jo grynumą. Paprastas ir patogus būdas tai padaryti yra patikrinti, kiek ultravioletinių spindulių jis sugeria esant 260 ir 280 nanometrų bangos ilgiui. Absorbcija esant 260 nanometrams, padalinta iš absorbcijos prie 280 nanometrų, turėtų būti lygi 1,8, jei DNR yra gryna. Matuojant absorbciją esant 260 nanometrų, taip pat galite nustatyti DNR koncentraciją.