Ląstelės genetinis projektas yra užkoduotas jos genetinėje medžiagoje arba DNR. Kadangi DNR niekada neišeina iš ląstelės branduolio, kad ši informacija patektų į citoplazmą, kur kiti baltymai ir biocheminiai komponentai, pirmiausia reikia DNR perrašyti į pasiuntinį RNR (mRNR arba poli (A) RNR). Tada ši MRNR virsta baltymais, kurie atlieka daug ląstelės funkcijų. Norint nustatyti ar kiekybiškai įvertinti labai retas MRNR, sudaryti mikrodalelių zondus arba sukonstruoti papildomas DNR molekules, reikia išskirti MRNR. Tačiau visiškas RNR (t. Y. Visos RNR ląstelėje) ekstrahavimas ir paskesnė mRNR išskyrimas nėra vienas kitą išskiriantys procesai; pirmoji turi būti atliekama, norint išgauti iRNR.
TRIzolio homogenizacija: bendra RNR apima visą mRNR, pernešimo RNR, ribosomų RNR ir kitus nekoduojančius RNR. Norint juos atskirti nuo kitų ląstelių komponentų, ląstelė pirmiausia atplėšiama, kad ją išlaisvintų turinį. Tai daroma resuspenduojant ląsteles, kurios granuliuotos centrifuguojant (sukant dideliu greičiu) TRIzol reagente („Life Technologies“). Panašiai veikia ir kitos TRIzol versijos (pvz., „Ambion“ TRI reagentas).
Bendras RNR išskyrimas: Norint atskirti skirtingus ląstelės komponentus (baltymus, DNR, RNR) suspensijoje arba fazėse, naudojama centrifugavimo serija. Viršutinė geltonos spalvos fazė susideda iš riebalų ir gali būti išmesta. Norima fazė yra tamsiai raudona, joje yra visa RNR ir ji lieka. Atlikus fenolio ir chloroformo ekstrahavimą ir keletą alkoholio plovimų naudojant izopropanolį ir etanolį, RNR gali būti granuliuojama izoliuoti iRNR. Pridėkite RNazės inhibitorių, kad šis fermentas nesugestų bendros RNR.
iRNR ekstrahavimas: paprastai naudojamas rinkinys izoliuoti iRNR, nes namie pagaminti laboratorijos protokolai nesudaro didelių kiekių labai išgrynintų MRNR. Komerciniuose rinkiniuose yra „Invitrogen“ „FastTrack 2.0“ arba „Ambion's Poly (A) Pure mRNR izoliacija“ Rinkinys. Šie pagrindiniai žingsniai yra bendri tokiems rinkiniams:
d) Centrifuguokite šį mėginį ir paimkite supernatantą, kuris kelis kartus plaunamas surišančiais ir mažai druskos turinčiais buferiais, esančiais rinkiniuose.
Literatūra
- "cDNA bibliotekos protokolai?"; Ianas G. Cowell ir Caroline A. Ostinas; 1997
- „In vitro transkripcijos ir vertimo protokolai?“; Martinas J. Tymms; 1995
Patarimai
- Visus reagentus, ląsteles ir RNR laikykite šaltai panardindami į ledą. Tai neleidžia RNR skaidyti jokiais kitais fermentais, kurie išsiskiria homogenizacijos proceso metu.
Įspėjimai
- Tokie reagentai kaip TRIzol yra toksiški ir neturi liestis su oda ar gleivinėmis. Dirbdami su šiuo reagentu, visada laikykitės saugių laboratorijos protokolų.
apie autorių
Palmeris Owyoungas turi tarptautinio verslo magistro laipsnį Kalifornijos universitete San Diege ir a Kalifornijos universitete, Santa Barbaroje, įgijęs sociologijos menų bakalaurą ir yra apmokytas molekulė biologas. Nuo 2006 m. Jis yra laisvai samdomas rašytojas. Be rašymo, jis yra visą laiką dirbantis „Forex“ prekybininkas ir interneto rinkodaros specialistas.
Nuotraukų kreditai
Jupiterimages / Photos.com / Getty Images
