세포의 유전 청사진은 유전 물질 또는 DNA 내에 암호화되어 있습니다. DNA는 세포의 핵을 절대로 떠나지 않기 때문에이 정보가 다른 곳에서 세포질로 들어가기 위해 단백질과 생화학 적 성분이 존재하기 때문에 먼저 DNA를 메신저 RNA (mRNA 또는 폴리)로 전사해야합니다. (A) RNA). 이 mRNA는 세포의 많은 기능을 수행하는 단백질로 번역됩니다. 매우 희귀 한 mRNA를 검출 또는 정량화하거나, 마이크로 어레이를위한 프로브를 만들거나, 상보적인 DNA 분자의 라이브러리를 구성하려면 mRNA를 분리해야합니다. 그러나 총 RNA (즉, 세포의 모든 RNA) 추출 및 후속 mRNA 분리는 상호 배타적 인 과정이 아닙니다. mRNA를 추출하려면 전자를 수행해야합니다.
TRIzol 균질화: 총 RNA에는 모든 mRNA, 전달 RNA, 리보솜 RNA 및 기타 비 코딩이 포함됩니다. RNA. 이들을 다른 셀룰러 구성 요소와 분리하기 위해 셀을 먼저 버스트 오픈하여 내용. 이는 TRIzol Reagent (Life Technologies)에서 원심 분리 (고속으로 회전)하여 펠릿 화 된 세포를 재현 탁하여 수행됩니다. 다른 버전의 TRIzol (예: Ambion의 TRI 시약)도 유사하게 작동합니다.
전체 RNA 분리: 일련의 원심 분리를 사용하여 세포의 여러 구성 요소 (단백질, DNA, RNA)를 현탁액 내에서 층 또는 단계로 분리합니다. 상단의 노란색 단계는 지방으로 구성되어 버릴 수 있습니다. 원하는상은 빨간색으로 착색되고 총 RNA를 포함하며 유지됩니다. 이소프로판올과 에탄올을 사용하여 페놀-클로로포름 추출 및 일련의 알코올 세척을 수행 한 후 RNA를 펠릿 화하여 mRNA 분리를 수행 할 수 있습니다. 이 효소가 총 RNA를 분해하지 못하도록 RNase 억제제를 추가하십시오.
mRNA 추출: 수제 실험실 프로토콜은 대량을 생성하지 않기 때문에 mRNA를 분리하기 위해 키트를 사용하는 것이 일반적입니다. 고도로 정제 된 mRNA의. 상용 키트에는 Invitrogen의 FastTrack 2.0 또는 Ambion의 Poly (A) Pure mRNA 분리가 포함됩니다. 전부. 이러한 기본 단계는 이러한 키트에 공통적입니다.
d)이 샘플을 원심 분리하고 키트에 제공된 일련의 결합 및 저염 완충액으로 여러 번 세척 된 상청액을 회수합니다.
참고 문헌
- "cDNA 라이브러리 프로토콜?"; 이안 G. Cowell과 Caroline A. 오스틴; 1997
- "체외 전사 및 번역 프로토콜?"; 마틴 J. Tymms; 1995
팁
- 얼음에 담가서 모든 시약, 세포 및 RNA를 차갑게 유지하십시오. 이것은 균질화 과정에서 방출되는 다른 효소에 의해 RNA가 분해되는 것을 방지합니다.
경고
- TRIzol과 같은 시약은 독성이 있으며 피부 나 점막과 접촉해서는 안됩니다. 이 시약을 취급 할 때는 항상 안전한 실험실 프로토콜을 준수하십시오.
저자 정보
Palmer Owyoung은 캘리포니아 대학교 샌디에이고에서 국제 비즈니스 석사 학위를 취득했으며 University of California at Santa Barbara에서 사회학 학사 학위를 받았으며 훈련 된 분자입니다. 생물 학자. 그는 2006 년부터 프리랜서 작가로 활동하고 있습니다. 글을 쓰는 것 외에도 그는 정규 Forex 상인이자 인터넷 마케팅 담당자입니다.
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