უჯრედის გენეტიკური გეგმა კოდირებულია მისი გენეტიკური მასალის, ან დნმ-ის ფარგლებში. ვინაიდან დნმ არასდროს ტოვებს უჯრედის ბირთვს, რათა ეს ინფორმაცია ციტოპლაზმაში მოხვდეს, სადაც სხვა ცილები და ბიოქიმიური კომპონენტები ცხოვრობენ, აუცილებელია დნმ-ის ტრანსკრიფცია მესენჯერი RNA- ში (mRNA ან პოლი (ა) რნმ). ეს mRNA შემდეგ გადადის ცილებად, რომლებიც ახორციელებენ უჯრედის მრავალ ფუნქციას. ძალიან იშვიათი mRNA– ების დასადგენად ან რაოდენობრივად დასადგენად, მიკრორაივებისთვის გამოკვლევა ან დამატებითი დნმ – ის მოლეკულების ბიბლიოთეკის შესაქმნელად, mRNA უნდა იყოს იზოლირებული. ამასთან, მთლიანი RNA (ე.ი. უჯრედში არსებული ყველა RNA) მოპოვება და შემდგომი mRNA– ს იზოლაცია არ არის ურთიერთგამომრიცხავი პროცესები; პირველი უნდა შესრულდეს იმისთვის, რომ mRNA მოიპოვონ.
TRIzol ჰომოგენიზაცია: მთლიანი RNA მოიცავს ყველა mRNA- ს, ტრანსფერულ RNA- ს, რიბოსომულ RNA- ს და სხვა არაკოდირს რნმ-ები. სხვა უჯრედული კომპონენტებისგან გამოსაყოფად, უჯრედი პირველ რიგში იხსნება, რომ გამოთავისუფლდეს შინაარსი ეს ხდება TRIzol რეაგენტში (სიცოცხლის ტექნოლოგიები) ცენტრიფუგირებით (მაღალი სიჩქარით ტრიალით) დაგროვილი უჯრედების ხელახლა შეჩერების გზით. TRIzol- ის სხვა ვერსიები (მაგალითად, Ambion's TRI რეაგენტი) ანალოგიურად მუშაობს.
მთლიანი რნმ-ის იზოლაცია: ცენტრიფუგაციების სერია გამოიყენება უჯრედის სხვადასხვა კომპონენტის (ცილები, დნმ, რნმ) სუსპენზიის ფარგლებში ფენებად ან ფაზებად გამოყოფისთვის. ზედა, ყვითელი ფერის ფაზა შედგება ცხიმისგან და შეიძლება განადგურდეს. სასურველი ფაზა შეფერილია წითლად, შეიცავს მთელ RNA– ს და ინარჩუნებს მას. ფენოლ-ქლოროფორმის მოპოვებისა და სპირტის მთელი რიგის გამრეცხვის შემდეგ იზოპროპანოლისა და ეთანოლის გამოყენებით, RNA შეიძლება მარცვლოვანი იყოს mRNA იზოლაციისთვის. დაამატეთ RNase ინჰიბიტორები, რომ თავიდან აიცილოთ ამ ფერმენტის საერთო RNA დეგრადაცია.
mRNA ექსტრაქცია: ჩვეულებრივია ნაკრების გამოყენება mRNA– ს გამოყოფისთვის, რადგან ხელნაკეთი ლაბორატორიული პროტოკოლები დიდ რაოდენობას არ წარმოქმნის მაღალგანწმენდილი მრნმ-ების. კომერციულ ნაკრებში შედის Invitrogen's FastTrack 2.0 ან Ambion's Poly (A) Pure mRNA იზოლაცია ნაკრები ეს ძირითადი ნაბიჯები საერთოა ასეთი კომპლექტებისთვის:
დ) მოახდინეთ ამ ნიმუშის ცენტრიფუგა და ზედმეტი ნივთიერების აღდგენა, რომელიც რამდენჯერმე გარეცხილია ნაკრებში მოწოდებული სავალდებულო და დაბალი მარილის ბუფერებით
გამოყენებული ლიტერატურა
- "cDNA ბიბლიოთეკის პროტოკოლები?"; იან გ. კოუელი და კაროლინ ა. ოსტინი; 1997
- "ინ ვიტრო ტრანსკრიფციისა და თარგმანის პროტოკოლები?"; მარტინ ჯ. საგალობლები; 1995
Რჩევები
- ყველა რეაგენტი, უჯრედი და RNA ცივად შეინახეთ ყინულში ჩაძირვით. ეს ხელს უშლის RNA– ს დეგრადაციას სხვა ფერმენტებით, რომლებიც გამოიყოფა ჰომოგენიზაციის პროცესში.
გაფრთხილებები
- ისეთი რეაგენტები, როგორიცაა TRIzol, ტოქსიკურია და არ უნდა ჰქონდეს კონტაქტი კანთან ან ლორწოვან გარსებთან. ყოველთვის დაიცავით უსაფრთხო ლაბორატორიული ოქმები ამ რეაგენტის დამუშავებისას.
ავტორის შესახებ
პალმერ ოუიუნგი ფლობს ხელოვნების მაგისტრის საერთაშორისო ბიზნესში კალიფორნიის უნივერსიტეტიდან სან დიეგოში და ა ხელოვნების ბაკალავრი სოციოლოგიაში სანტა ბარბარეს კალიფორნიის უნივერსიტეტიდან და არის გაწვრთნილი მოლეკულა ბიოლოგი. 2006 წლიდან არის დამოუკიდებელი მწერალი. მწერლობის გარდა, ის არის Forex– ის სრული დროით მოვაჭრე და ინტერნეტ მარკეტინგის სპეციალისტი.
ფოტო კრედიტები
Jupiterimages / Photos.com / Getty Images