La reazione a catena della polimerasi, o PCR, è una tecnica che fotocopia un frammento di DNA in molti frammenti, esponenzialmente molti. Il primo passo nella PCR consiste nel riscaldare il DNA in modo che si denatura o si sciolga in singoli filamenti. La struttura del DNA è come una scala di corda in cui i pioli sono corde con estremità magnetiche. I magneti si collegano per formare i pioli, chiamati coppie di basi, e quindi resistono a essere separati. Ogni frammento di DNA si fonde in singoli filamenti a temperature diverse. Capire come la struttura del DNA è tenuta insieme dalle singole parti del DNA darà un'idea del perché diversi frammenti di DNA si sciolgono a temperature diverse e perché sono necessarie temperature così elevate nel primo? posto.
Fusione! Fusione!
Il primo passo della PCR consiste nel fondere il DNA in modo che il DNA a doppio filamento si separi in DNA a filamento singolo. Per il DNA dei mammiferi, questo primo passaggio di solito comporta un calore di circa 95 gradi Celsius (circa 200 Fahrenheit). A questa temperatura i legami idrogeno tra le coppie di basi AT e GC, o pioli nella scala del DNA, si rompono, aprendo la cerniera del DNA a doppio filamento. Tuttavia, la temperatura non è abbastanza calda da rompere la spina dorsale di fosfato-zucchero che forma i singoli filamenti, o i poli della scala. La separazione completa dei singoli filamenti li prepara alla seconda fase della PCR, che si raffredda per consentire a brevi frammenti di DNA, chiamati primer, di legare i singoli filamenti.
Cerniere magnetiche
Uno dei motivi per cui il DNA viene riscaldato all'alta temperatura di 95 gradi Celsius è che più lungo è il doppio filamento del DNA, più vuole stare insieme. La lunghezza del DNA è un fattore che influenza il punto di fusione scelto per la PCR su quel pezzo di DNA. Le coppie di basi AT e GC nel DNA a doppio filamento si legano tra loro per tenere insieme la struttura a doppio filamento. Più coppie di basi consecutive tra due filamenti singoli si sono legate, più anche i loro vicini vogliono legarsi e più forte diventa l'attrazione tra i due filamenti. È come una cerniera fatta di piccoli magneti. Quando chiudi la cerniera, i magneti vorranno naturalmente chiudersi e rimanere chiusi.
I magneti più forti aderiscono più saldamente
Un altro fattore che influenza la temperatura di fusione da scegliere per il frammento di DNA di interesse è la quantità di coppie di basi G-C presenti in quel frammento. Ogni coppia di basi è come due mini-magneti che si attraggono. Una coppia composta da G e C è molto più fortemente attratta di una coppia A e T. Quindi un pezzo di DNA che ha più coppie G-C di un altro frammento richiederà una temperatura più alta prima di fondersi in singoli filamenti. Il DNA assorbe naturalmente la luce ultravioletta - alla lunghezza d'onda di 260 nanometri, per l'esattezza - e il DNA a singolo filamento assorbe più luce del DNA a doppio filamento. Quindi misurare la quantità di luce assorbita è un modo per misurare quanto il tuo DNA a doppio filamento si è fuso in filamenti singoli. L'effetto "cerniera magnetica" delle coppie di basi G-C e A-T è ciò che provoca un grafico dell'assorbimento della luce di DNA a doppio filamento tracciato contro un aumento della temperatura per essere sigmoidale, a forma di S, e non a retta. La curva della S rappresenta la resistenza del lavoro di squadra che le coppie di basi esercitano contro il calore perché non si vogliono separare.
Il punto a metà
La temperatura alla quale una lunghezza di DNA si scioglie in singoli filamenti è chiamata temperatura di fusione, che è indicata con l'abbreviazione "Tm". Indica la temperatura alla quale metà del DNA in una soluzione si è fusa in filamenti singoli e l'altra metà è ancora in filamento doppio modulo. La temperatura di fusione è diversa per ogni frammento di DNA. Il DNA dei mammiferi ha un contenuto di G-C del 40%, il che significa che il restante 60% delle coppie di basi sono As e Ts. Il suo contenuto di GC del 40% fa sì che il DNA dei mammiferi si sciolga a 87 gradi Celsius (circa 189 Fahrenheit). Questo è il motivo per cui il primo passo della PCR sul DNA dei mammiferi è riscaldarlo a 94 gradi Celsius (201 Fahrenheit). Solo sette gradi più caldi della temperatura di fusione e tutti i doppi fili si fonderanno completamente in singoli fili.
