Secondo il sito Web BioWeb dell'Università del Wisconsin, un primer per PCR è un breve oligonucleotide sintetico (di solito tra 18 fino a 25 basi) utilizzato per amplificare regioni specifiche del DNA in una tecnica di biologia molecolare nota come reazione a catena della polimerasi (PCR). Sono necessari sia un primer diretto che uno inverso, progettati per essere complementi inversi del filamento di DNA, per affiancare e legarsi alla regione di DNA desiderata. Quando gli scienziati vogliono eseguire ricerche su un gene specifico o una regione del DNA, devono prima eseguire la PCR per acquisire una quantità sufficiente della regione bersaglio con cui lavorare. Potrebbe essere necessario progettare sequenze di primer per la regione di interesse se non sono già disponibili attraverso ricerche precedentemente pubblicate o con mezzi commerciali.
Ottieni la sequenza nucleotidica del gene o della regione del DNA di interesse e decidi per quanto tempo desideri amplificare un frammento. Il primer avanti e indietro è progettato per legarsi all'inizio e alla fine del frammento desiderato. In genere, i metodi PCR convenzionali utilizzano primer che fiancheggiano una regione lunga da 100 a 1.000 paia di basi, mentre i metodi PCR in tempo reale utilizzano frammenti lunghi da 50 a 200 paia di basi.
Decidi dove nella sequenza vuoi che si trovino i primer. Ad esempio, potresti volere la posizione vicino all'estremità 5' o 3' della sequenza o nel mezzo. Se lo si desidera, designare la posizione dei primer su un introne.
Primer di design da 18 a 24 basi di lunghezza. Vincenzo R. Prezioso, Ph. D., di Brinkmann Instruments Inc., suggerisce che questa lunghezza è abbastanza lunga da essere estremamente specifica per la regione del DNA desiderata, ma abbastanza corta da legarsi (ricottura) facilmente. La temperatura di fusione del primer (Tm) dovrebbe essere compresa tra 55 e 80 gradi Celsius, abbastanza bassa da consentire la fusione completa pari o superiore a 90 gradi Celsius, ma sufficientemente alta da consentire la ricottura. Il contenuto di GC (percentuale di G e C nella sequenza) dovrebbe essere compreso tra il 40 e il 60 percento. L'estremità 3' della sequenza di primer dovrebbe terminare con una C o una G (chiamata morsetto GC) per promuovere il legame, poiché G e C i nucleotidi hanno legami più forti, tuttavia, evita di avere tre o più G o C nelle ultime cinque basi della sequenza.
Evita di eseguire corse di quattro o più di una base (come ACCCC...) o quattro o più ripetizioni di-nucleotidiche (come AATATAT...) perché possono causare errori di priming. Primer di design senza omologia intra-primer (più di tre basi che si completano all'interno di una primer stesso) o omologia inter-primer (dove il primer diretto e inverso hanno complemento sequenze). Ciò può causare auto-dimeri o primer-dimeri, in cui i primer si legano a se stessi invece di legarsi alla sequenza di DNA desiderata.
Utilizzare risorse online e siti Web che assistono nella progettazione di primer o aiutano a controllare le sequenze di primer per l'autocomplementarità o il potenziale per creare strutture secondarie come le forcine. Alcuni siti Web di progettazione di primer includono Primer3 del Massachusetts Institute of Technology, Primer-Blast del National Center for Biotechnology Information e OligoAnalyzer di Integrated DNA Technologies.