Tris, o tris (idrossimetil) aminometano, è un comune tampone biologico, utilizzato durante il processo di estrazione del DNA. Durante l'estrazione da un numero qualsiasi di fonti, il DNA è sensibile al pH. Durante la lisi cellulare, la rimozione dei componenti cellulari indesiderati e la precipitazione, il tris viene utilizzato per mantenere un pH stabile. Inoltre, svolge un ruolo particolarmente importante nella lisi cellulare.
TL; DR (troppo lungo; non ho letto)
L'estrazione del DNA è un processo sensibile al pH e l'utilizzo di un tampone tris aiuta a mantenere il pH stabile durante la lisi e l'estrazione cellulare.
Tris come Buffer
Poiché il pH può influenzare ed essere influenzato da una serie di fattori cellulari, il mantenimento di un pH stabile è essenziale per la scienza sperimentale. I tamponi biologici, come il tris, sono importanti perché possono mantenere un pH stabile nonostante le influenze che potrebbero altrimenti modificare il pH. Il tris (idrossimetil) aminometano, con un pKa di 8,1, è un efficace tampone tra pH 7 e 9. A causa della sua gamma neutra, il tris è un tampone comunemente usato nei laboratori biologici. Tuttavia, il tampone tris è sensibile alla temperatura e dovrebbe essere utilizzato alla temperatura alla quale è stato originariamente pH per evitare imprecisioni.
Lisi delle cellule
La lisi, o rottura delle cellule, è il primo passo dell'estrazione del DNA. Ciò è ottenuto da un tampone contenente tris ed EDTA (acido etilendiamminotetraacetico). L'EDTA lega cationi bivalenti come calcio e magnesio. Poiché questi ioni aiutano a mantenere l'integrità della membrana cellulare, eliminarli con EDTA destabilizza la membrana. Tris è il principale componente di buffering; il suo ruolo principale è quello di mantenere il pH del tampone a un punto stabile, solitamente 8,0. Inoltre, tris probabilmente interagisce con l'LPS (lipopolisaccaride) nella membrana, servendo a destabilizzare la membrana ulteriore.
Tris protegge il DNA dagli sbalzi di pH
Quando le cellule vengono spezzate, il loro DNA e il loro contenuto si riversano nel tampone. Inoltre, sono spesso incluse RNasi A (distrugge l'RNA), proteasi (distrugge le proteine) e SDS (sodio dodecil solfato, solubilizza i frammenti di membrana). Presi insieme, questa zuppa di contenuto cellulare e RNA e proteine frammentati può avere un grande impatto sul pH della soluzione. Poiché il DNA è sensibile al pH, è importante che il tris tamponi la zuppa e mantenga il pH a un punto stabile.
Precipitazione del DNA
Nella fase finale dell'estrazione del DNA, il DNA stesso viene estratto dalla soluzione. A questo punto, il DNA è solubile nel tampone. Per estrarre dalla soluzione, il DNA viene reso insolubile aggiungendo etanolo o isopropanolo (alcol isopropilico). Quando questo è fatto, il DNA diventa evidente in soluzione come una sostanza filamentosa bianca. Sebbene il DNA possa essere isolato dai restanti componenti cellulari in questo modo, non è "utilizzabile" quando è insolubile. Dopo l'isolamento, l'alcol viene rimosso e il DNA deve essere restituito a un tampone biologico, come il tris, per essere utilizzato.
Fallo da solo
Sebbene l'estrazione del DNA venga comunemente eseguita nei laboratori di ricerca, generalmente utilizzando uno dei numerosi kit disponibili in commercio, chiunque può eseguire l'estrazione del DNA a casa utilizzando oggetti domestici comuni e verde piselli o spinaci. In questo caso, tris, né alcun tampone biologico, non è presente per proteggere il DNA dagli spostamenti del pH. Tuttavia, è un modo visivo per aiutare gli studenti a connettersi con il DNA cellulare.