Il progetto genetico di una cellula è codificato all'interno del suo materiale genetico, o DNA. Poiché il DNA non lascia mai il nucleo della cellula, affinché queste informazioni entrino nel citoplasma dove altre risiedono proteine e componenti biochimici, è necessario prima trascrivere il DNA in RNA messaggero (mRNA o poli (A)RNA). Questo mRNA viene quindi tradotto in proteine che svolgono molte funzioni della cellula. Per rilevare o quantificare mRNA molto rari, realizzare sonde per microarray o costruire librerie di molecole di DNA complementari, l'mRNA deve essere isolato. Tuttavia, l'estrazione dell'RNA totale (cioè tutto l'RNA in una cellula) e il successivo isolamento dell'mRNA non sono processi che si escludono a vicenda; il primo deve essere eseguito per estrarre l'mRNA.
Omogeneizzazione del TRIzol: l'RNA totale include tutto l'mRNA, l'RNA di trasferimento, l'RNA ribosomiale e altri non codificanti RNA. Per separarli dagli altri componenti cellulari, la cellula viene prima aperta per rilasciare il suo Contenuti. Questo viene fatto risospendendo le cellule pellettizzate mediante centrifugazione (spinning ad alta velocità) in TRIzol Reagent (Life Technologies). Altre versioni di TRIzol (come il reagente TRI di Ambion) funzionano in modo simile.
Isolamento totale dell'RNA: una serie di centrifugazioni viene utilizzata per separare i diversi componenti (proteine, DNA, RNA) della cellula in strati, o fasi, all'interno della sospensione. La fase superiore, di colore giallo, è composta da grasso e può essere scartata. La fase desiderata è colorata di rosso, contiene l'RNA totale e viene trattenuta. Dopo aver eseguito un'estrazione fenolo-cloroformio e una serie di lavaggi con alcol utilizzando isopropanolo ed etanolo, l'RNA può essere pellettato per l'isolamento dell'mRNA. Aggiungere inibitori della RNasi per impedire a questo enzima di degradare l'RNA totale.
Estrazione di mRNA: è comune utilizzare un kit per isolare gli mRNA, poiché i protocolli di laboratorio fatti in casa non generano grandi quantità di mRNA altamente purificati. I kit commerciali includono FastTrack 2.0 di Invitrogen o Poly (A)Pure mRNA Isolation di Ambion Kit. Questi passaggi di base sono comuni a tali kit:
d) Centrifugare questo campione e recuperare il surnatante, che viene lavato più volte in una serie di tamponi leganti ea basso contenuto di sale forniti nei kit.
Riferimenti
- "Protocolli della libreria cDNA?"; Ian G. Cowell e Caroline A. Austin; 1997
- "Trascrizione in vitro e protocolli di traduzione?"; Martin J. Timi; 1995
Suggerimenti
- Mantenere freddi tutti i reagenti, le cellule e l'RNA immergendoli nel ghiaccio. Ciò impedisce che l'RNA venga degradato da altri enzimi che vengono rilasciati durante il processo di omogeneizzazione.
Avvertenze
- I reagenti come TRIzol sono tossici e non devono entrare in contatto con la pelle o le mucose. Osservare sempre i protocolli di laboratorio sicuri quando si maneggia questo reagente.
Circa l'autore
Palmer Owyoung ha conseguito un Master of Arts in International Business presso l'Università della California a San Diego e a Laureato in sociologia presso l'Università della California a Santa Barbara ed è un esperto molecolare biologo. Svolge attività di scrittore freelance dal 2006. Oltre a scrivere, è un trader Forex a tempo pieno e un Internet marketer.
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