I batteri vengono coltivati in piastre Petri su un terreno solido noto come agar batterico, dove si formano colonie sollevate e circolari. A differenza di una singola cellula batterica, una colonia è un gruppo di batteri abbastanza grande da essere visibile ad occhio nudo. La crescita batterica può essere misurata semplicemente osservando quante colonie sono presenti; tuttavia, metodi più quantitativi includono l'uso di una camera di conteggio o, più spesso, conte vitali su piastre. Quest'ultimo viene utilizzato più frequentemente in quanto fornisce anche informazioni qualitative come l'effetto delle diverse condizioni di crescita. Poiché potrebbero esserci miliardi di batteri in una capsula di Petri, la misurazione prima richiede la diluizione del campione in modo che sia possibile contare il numero di colonie.
In una provetta, aggiungere 10 microlitri della coltura batterica di partenza a 90 microlitri di mezzo di diluizione. Chiudere bene il coperchio della provetta e agitare delicatamente per ottenere una miscela omogenea. Ora il campione è un decimo della sua concentrazione originale.
Trasferire 10 microlitri di questo nuovo campione in una nuova provetta contenente 90 microlitri di mezzo di diluizione, mescolare nuovamente. Ancora una volta, il risultato sarà il campione ulteriormente diluito - ora sarà un centesimo della sua concentrazione originale. Ripetere più volte, fino a quando il campione originale è stato diluito tra 104 e 1010 volte. Assicurarsi che ogni provetta sia etichettata con la diluizione corretta, ad esempio 10-1, 10-2 e così via.
Dispensare 10 microlitri dell'ultima diluizione completata sulla piastra di agar. Utilizzando il bordo di diffusione, distribuire la soluzione batterica su tutta la superficie della piastra di agar. Ripeti l'operazione per altri due piatti. È anche comune eseguire questi passaggi con altri livelli di diluizione per il confronto. Assicurati di etichettare il fondo dei piatti. Riposizionare i coperchi su ciascuna piastra e lasciare asciugare le piastre di agar per diversi minuti su un banco da laboratorio sotto una fiamma o in un incubatore. Collocare le piastre nell'incubatrice che deve essere impostata alla temperatura appropriata per il ceppo di batteri. Lasciare crescere dalle 12 alle 16 ore.
Le colonie dovrebbero essere visibili dopo 16 ore; tuttavia, alcune modificazioni genetiche possono richiedere più tempo (ad esempio, lo sviluppo del colore). Quando le colonie sono osservabili, estrarre le piastre e trovare quelle che hanno tra le 30 e le 300 colonie. Usando un pennarello indelebile, posiziona un punto sul fondo della capsula di Petri - il lato con l'agar, non il coperchio - ovunque sia visibile una colonia attraverso l'agar. Conta ogni punto marcatore. Ripetere per ogni piatto.
Per misurare la quantità di batteri nella coltura di partenza per questo esperimento, la diluizione deve essere invertita nei calcoli, in due punti. In primo luogo, quando hai preso un microlitro dalla provetta per metterlo nella capsula di Petri, hai preso un decimo del campione diluito, quindi devi moltiplicare tutto per 10 per invertire questo. Inoltre, se il fattore di diluizione nella provetta fosse, ad esempio, 10-7, quindi il numero di colonie deve essere moltiplicato per 107 per invertire l'effetto di diluizione. Basta rimuovere il segno negativo dall'esponente nei calcoli. Usa la formula:
[Numero di colonie contate] × 10 × [quante volte il campione deve essere moltiplicato per raggiungere la concentrazione originale: ad esempio 105] = Numero di unità formanti colonia (CFU) per millilitro di coltura iniziale. Questa è la crescita batterica nelle tue piastre di Petri.