Apa Fungsi Tracking Dye dalam Elektroforesis Gel?

Elektroforesis gel adalah teknik laboratorium yang umum digunakan dengan banyak aplikasi praktis termasuk sidik jari DNA dan sekuensing genom. Prosesnya melibatkan pemisahan DNA fragmen menggunakan arus listrik sambil melacak laju pergerakan molekul melalui gel penyaringan.

Menambahkan pewarna pelacak biru atau oranye ke sampel DNA yang tidak berwarna memungkinkan Anda melihat sampel Anda dan memperoleh informasi tentang bagaimana molekul DNA bergerak selama elektroforesis. Identifikasi didasarkan pada ukuran pita DNA pada gel setelah migrasi molekul.

Elektroforesis gel menarik fragmen DNA melalui gel menggunakan arus listrik untuk mengisolasi dan mengidentifikasi molekul DNA berdasarkan ukuran dan muatan listrik. Gel sering dibuat dengan bubuk agarosa — polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut.

Agarosa ditambahkan ke larutan buffer air dan garam, dan campuran dipanaskan dan didinginkan untuk membuat gel berpori yang akan bertindak sebagai matriks penyaringan selama prosedur elektroforesis. Gel kemudian ditempatkan dalam unit elektroforesis dan ditutup dengan larutan buffer yang menghantarkan

Larutan yang mengandung DNA dan loading dye dipipet ke dalam sumur kecil di dalam gel yang harus dibuat selama preparasi gel. pewarnatolong kamujelas melihat sampel yang Anda tambahkan ke sumur gel yang terletak di dekat elektroda negatif unit elektroforesis.

Elektroda positif terletak di ujung yang berlawanan. Standar fragmen DNA yang diketahui ditempatkan di sumur pertama yang akan membuat tangga pita DNA untuk tujuan perbandingan dan identifikasi.

Tulang punggung fosfat molekul DNA memberi DNA muatan negatif. Berlawanan menarik sehingga, akibatnya, molekul DNA tertarik ke elektroda positif dan mulai bergerak, atau "bermigrasi," ketika arus listrik dihidupkan.

Fragmen DNA berukuran lebih kecil bergerak lebih cepat daripada fragmen yang lebih besar karena mereka menghadapi lebih sedikit resistensi saat mereka bermigrasi melalui matriks berpori gel. Fragmen DNA berukuran serupa membentuk pita DNA dalam gel.

DNA tidak berwarna, jadi tambahkan pewarna pelacakan untuk sampel membantu Anda tentukan kecepatan gerak molekul protein ukuran yang berbeda dalam gel selama elektroforesis. Contoh pewarna pemuatan yang bergerak dengan sampel DNA meliputi: bromofenolbiru dan xilena sianol.

Pewarna yang dipilih tidak boleh reaktif atau mengubah DNA. Bromophenol blue adalah pewarna yang digunakan untuk melacak untaian DNA berukuran lebih kecil yang mengandung sekitar 400 pasangan basa, sedangkan xylene cyanol lebih baik untuk untaian DNA yang lebih besar dengan hingga 8.000 pasangan basa. Pewarna yang dipilih tidak boleh reaktif atau mengubah DNA.

Saat menyiapkan sampel DNA Anda untuk elektroforesis, Anda perlu menambahkan gliserol dan air bersama dengan pewarna yang dimuat. Gliserol adalah zat berat seperti sirup yang memberikan kepadatan lebih pada sampel DNA sebelum dimasukkan ke dalam lubang di salah satu ujung lembaran gel.

Tanpa gliserol, sampel DNA akan menyebar bukannya tenggelam dan membentuk lapisan di dalam sumur seperti yang seharusnya dilakukan untuk membentuk tangga DNA.

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE) adalah teknik yang cocok untuk memisahkan protein dan asam amino, yang lebih kecil dan lebih kompleks daripada molekul DNA linier. Poliakrilamida (gel SDS PAGE) digunakan sebagai pengganti gel agarosa untuk elektroforesis.

Bromophenol blue (BPB) ditambahkan ke buffer sampel sebagai pewarna pelacakan yang bergerak ke arah yang sama untuk memisahkan protein dan membatasi tepi terdepannya.

Pewarna pengikat DNA seperti: berwarna oranye etidium bromida dapat ditambahkan ke gel atau buffer elektroforesis. Seperti namanya, pewarna menempel pada molekul DNA.

Harus sangat hati-hati saat menangani pewarna mutagenik ini karena dapat mengikat DNA dalam sel kulit. Tidak seperti pewarna pelacak, etidium bromida berpendar cerah di bawah sinar UV, membuat pita DNA terlihat.