Kelebihan dan Kekurangan Western Blot

Western blot, teknik analisis yang digunakan untuk menentukan protein spesifik dalam sampel tertentu, menggunakan kemampuan enzim atau antibodi primer berlabel fluoresensi untuk mengikat antigen spesifiknya. Ini adalah proses tiga langkah yang dimulai dengan elektroforesis gel, diikuti dengan membran blotting dan probing dengan antibodi. Deteksi protein mungkin langsung atau tidak langsung, dengan yang terakhir menggunakan antibodi sekunder berlabel yang diarahkan terhadap primer. Meskipun diterima sebagai teknik analisis protein rutin, western blot memiliki keterbatasan serta manfaat.

Salah satu argumen terbesar yang mendukung western blot adalah sensitivitasnya. Karena kemampuannya untuk mendeteksi sesedikit 0,1 nanogram protein dalam sampel, teknik ini secara teoritis dapat berfungsi sebagai: alat diagnostik awal yang efektif, merasakan respons imunogenik sekecil apa pun dari virus atau bakteri pada pasien Sampel. Western blot tidak langsung selanjutnya dibangun di atas sensitivitas ini dari kemampuan antibodi sekunder untuk memperkuat intensitas sinyal yang dideteksi oleh sistem pencitraan. Sensitivitas yang lebih besar berarti bahwa lebih sedikit antibodi yang diperlukan untuk pengujian, yang mengurangi biaya laboratorium secara signifikan.

Teknik western blot berutang kekhususannya pada dua faktor yang berkontribusi besar. Pertama, elektroforesis gel menyortir sampel menjadi protein dengan ukuran, muatan, dan konformasi yang berbeda. Proses ini sendiri merupakan langkah besar menuju deteksi, karena pita yang terbentuk dalam gel sudah memberikan petunjuk tentang ukuran protein atau polipeptida yang diinginkan. Spesifisitas interaksi antibodi-antigen berfungsi sebagai faktor besar kedua. Karena antibodi spesifik menunjukkan afinitas terhadap protein spesifik, proses tersebut dapat secara selektif mendeteksi protein target bahkan dalam campuran 300.000 protein yang berbeda.

Terlepas dari sensitivitas dan spesifisitasnya, western blot masih dapat menghasilkan hasil yang salah. Hasil positif palsu ketika antibodi bereaksi dengan protein yang tidak dimaksudkan, itulah yang sering terjadi ketika seorang pasien yang dites HIV kebetulan menderita tuberkulosis atau sejumlah parasit infeksi. Negatif palsu, di sisi lain, dapat dengan mudah terjadi jika protein yang lebih besar tidak diberikan waktu yang cukup untuk mentransfer dengan benar ke membran. Blotting dan pemrosesan yang tidak tepat sering kali menghasilkan pita yang miring, pudar, atau bahkan banyak pita, sehingga hasil pengujian bergantung pada interpretasi teknisi.

Biaya western blot adalah gabungan dari pengeluaran individu yang besar untuk antibodi yang ditandai, analis terampil, dan peralatan laboratorium. Proses yang rumit, western blotting membutuhkan ketelitian di setiap langkah untuk identifikasi yang tepat dari konstituen sampel. Sebuah kesalahan kecil dalam konsentrasi reagen atau dalam masa inkubasi dapat menjadi bencana bagi seluruh proses. Akhirnya, peralatan yang diperlukan untuk deteksi dan pencitraan - sistem deteksi chemiluminescent, fluorescent, radioaktif, atau laser - bisa terlalu mahal untuk unit mikrobiologi rata-rata.