Cetak biru genetik sel dikodekan dalam materi genetiknya, atau DNA. Karena DNA tidak pernah meninggalkan inti sel, agar informasi ini masuk ke sitoplasma di mana lainnya protein dan komponen biokimia berada, pertama-tama perlu menyalin DNA menjadi messenger RNA (mRNA atau poli .). (A) RNA). MRNA ini kemudian diterjemahkan menjadi protein yang menjalankan banyak fungsi sel. Untuk mendeteksi atau mengukur mRNA yang sangat langka, membuat probe untuk microarrays atau membangun perpustakaan molekul DNA komplementer, mRNA harus diisolasi. Namun, ekstraksi RNA total (yaitu semua RNA dalam sel) dan isolasi mRNA berikutnya bukanlah proses yang saling eksklusif; yang pertama harus dilakukan agar mRNA dapat diekstraksi.
Homogenisasi TRIzol: RNA total mencakup semua mRNA, RNA transfer, RNA ribosom, dan noncoding lainnya RNA. Untuk memisahkannya dari komponen seluler lainnya, sel pertama-tama dibuka untuk melepaskannya isi. Hal ini dilakukan dengan meresuspensi sel yang dipelet dengan sentrifugasi (berputar dengan kecepatan tinggi) dalam TRIzol Reagent (Life Technologies). Versi TRIzol lainnya (seperti Reagen TRI Ambion) bekerja dengan cara yang sama.
Isolasi RNA Total: Serangkaian sentrifugasi digunakan untuk memisahkan berbagai komponen (protein, DNA, RNA) sel menjadi lapisan, atau fase, dalam suspensi. Bagian atas, fase berwarna kuning terdiri dari lemak dan dapat dibuang. Fase yang diinginkan diwarnai merah, mengandung RNA total dan dipertahankan. Setelah melakukan ekstraksi fenol-kloroform dan serangkaian pencucian alkohol menggunakan isopropanol dan etanol, RNA dapat dibuat pellet untuk isolasi mRNA. Tambahkan inhibitor RNase untuk mencegah enzim ini mendegradasi RNA total.
Ekstraksi mRNA: Adalah umum untuk menggunakan kit untuk mengisolasi mRNA, karena protokol lab buatan sendiri tidak menghasilkan jumlah besar dari mRNA yang sangat murni. Kit komersial termasuk FastTrack 2.0 Invitrogen atau Poly (A) Pure mRNA Isolation dari Ambion Paket Langkah-langkah dasar ini umum untuk kit tersebut:
d) Sentrifugasi sampel ini dan pulihkan supernatannya, yang dicuci beberapa kali dalam serangkaian buffer garam rendah dan pengikat yang disediakan dalam kit.
Referensi
- "Protokol Perpustakaan cDNA?"; Ian G. Cowell dan Caroline A. Austin; 1997
- "Protokol Transkripsi dan Terjemahan In Vitro?"; Martin J. Timm; 1995
Tips
- Jauhkan semua reagen, sel dan RNA dingin dengan merendam dalam es. Ini mencegah RNA terdegradasi oleh enzim lain yang dilepaskan selama proses homogenisasi.
Peringatan
- Reagen seperti TRIzol bersifat toksik dan tidak boleh kontak dengan kulit atau selaput lendir. Selalu patuhi protokol lab yang aman saat menangani reagen ini.
tentang Penulis
Palmer Owyoung meraih gelar Master of Arts dalam bisnis internasional dari University of California di San Diego dan a Bachelor of Arts dalam sosiologi dari University of California di Santa Barbara dan merupakan molekul terlatih ahli biologi. Ia menjadi penulis lepas sejak tahun 2006. Selain menulis, ia adalah pedagang Forex dan pemasar Internet penuh waktu.
Kredit Foto
Jupiterimages/Photos.com/Getty Images