Spektrofotometri adalah alat yang sangat berharga dalam kimia dan biologi. Ide dasarnya sederhana: zat yang berbeda menyerap cahaya/radiasi elektromagnetik lebih baik pada beberapa panjang gelombang daripada yang lain. Itu sebabnya beberapa bahan transparan sementara yang lain berwarna, misalnya. Ketika Anda menyinari cahaya dengan panjang gelombang tertentu melalui suatu larutan, semakin tinggi konsentrasinya, semakin banyak cahaya yang akan diserapnya. Untuk menghitung konsentrasi, Anda perlu membandingkan bacaan Anda dengan bacaan untuk standar konsentrasi yang diketahui. Prosedur di bawah ini adalah prosedur yang cukup umum yang ditulis dengan mempertimbangkan lab pengajaran kimia, tetapi dapat dimodifikasi untuk pengaturan lain juga.
Seperti biasa saat bekerja di lab, kenakan kacamata, sarung tangan, dan mantel lengan panjang Anda untuk memastikan keselamatan Anda sendiri.
Peras bohlam karet untuk mengosongkannya dari udara, lalu letakkan di atas pipet ukur Anda dan biarkan bohlam rileks sehingga menyedot air ke dalam pipet. Selanjutnya, lepaskan bohlam, dan tutup bagian atas pipet dengan jari Anda; ini akan menutup pipet sehingga larutan di dalamnya tidak mengalir keluar sampai jari Anda dikeluarkan. Angkat ujung jari Anda sedikit agar sedikit larutan mengalir keluar dari pipet, hingga Anda mencapai volume yang diinginkan. Berlatihlah dengan air dan gelas kimia untuk merasakan cara kerja pipet bertingkat. Tautan di bawah bagian Sumber Daya memiliki klip film untuk menunjukkan cara menggunakan pipet jika Anda belum pernah menggunakannya sebelumnya.
Beri label 5 tabung reaksi sebagai standar 1-5. Anda dapat memberi label menggunakan selotip dan pena atau menggunakan spidol penghapus kering.
Pilih lima konsentrasi untuk standar Anda. Anda ingin konsentrasi standar dipisahkan satu sama lain dengan interval yang hampir sama -- misalnya, 0,1 molar, 0,2 molar, 0,3 molar, dll. -- dan dalam kisaran yang kira-kira sama dengan apa yang Anda harapkan dari yang tidak diketahui. Untuk saat ini, gunakan lima konsentrasi berikut, tetapi ingat bahwa Anda perlu memodifikasi ini saat melakukan eksperimen Anda sendiri:
Standar 1: 0,1 molar Standar 2: 0,2 molar Standar 3: 0,3 molar Standar 4: 0,4 molar Standar 5: 0,5 molar
Selanjutnya, ambil larutan standar 1 molar dan tambahkan jumlah berikut ke tabung reaksi 1-5. Ingat, jumlah ini dihitung menggunakan konsentrasi yang tercantum di atas, jadi Anda mungkin perlu mengubahnya sesuai kebutuhan saat melakukan eksperimen sendiri.
Standar 1: 0,8 mililiter Standar 2: 1,6 mililiter Standar 3: 2,4 mililiter Standar 4: 3,2 mililiter Standar 5: 4 mililiter
Bilas pipet bertingkat, lalu pindahkan sejumlah air deionisasi berikut:
Standar 1: 7,2 mililiter Standar 2: 6,4 mililiter Standar 3: 5,6 mililiter Standar 4: 4,8 mililiter Standar 5: 4,0 mililiter
Pada dasarnya, idenya adalah untuk membawa jumlah larutan di setiap tabung hingga 8 mililiter.
Tutup masing-masing tabung standar dengan parafilm dan balikkan agar tercampur.
Tandai lima tabung reaksi lainnya sebagai "Tidak Diketahui 1-5." Tambahkan jumlah yang sama dari larutan yang tidak diketahui atau larutan uji ke masing-masing seperti yang Anda gunakan dengan larutan 1 molar untuk standar. Dengan kata lain, 1 yang tidak diketahui akan berisi 0,8 mililiter larutan uji dan 7,2 mililiter air, tidak diketahui 2 akan berisi 1,6 mililiter larutan uji dan 6,4 mililiter air, dan seterusnya maju.
Tutup masing-masing yang tidak diketahui dengan parafilm, dan dengan hati-hati balikkan untuk mencampur.
Nyalakan spektrofotometer dan biarkan memanas. Lamanya waktu yang diperlukan akan tergantung pada model dan pabrikan.
Atur panjang gelombang pada spektrofotometer. Panjang gelombang akan tergantung pada jenis bahan kimia dalam percobaan Anda. Untuk saat ini, asumsikan 500 nm, meskipun ingat bahwa Anda perlu mengubah ini untuk eksperimen yang berbeda.
Kalibrasi spektrofotometer Anda. Prosedur kalibrasi akan bervariasi tergantung pada perangkat yang Anda gunakan. Untuk Spectronic 20, model umum di lab pengajaran, Anda akan menyesuaikan mesin terlebih dahulu sehingga berbunyi "0 persen T" bila tidak ada kuvet yang dimuat, maka sesuaikan sehingga berbunyi "100 % T" bila kuvet kosong yang hanya berisi air deionisasi sarat. Prosedur ini dapat bervariasi tergantung pada jenis mesin yang Anda gunakan, jadi konsultasikan dengan instruksi pabrik untuk detailnya.
Setelah mesin dikalibrasi, ambil tabung reaksi standar 1 dan tuangkan isinya ke dalam kuvet bersih sampai mencapai garis pengisian. Lap kuvet dengan kimwipe untuk menghilangkan sidik jari atau kotoran lainnya. Masukkan kuvet ke dalam spektrofotometer dan catat pembacaan "%T".
Ulangi prosedur ini untuk semua 10 sampel. PASTIKAN untuk membersihkan kuvet di antara sampel untuk memastikan hasil Anda seakurat mungkin.
Ambil hasilnya untuk standar Anda dan masukkan ke dalam program spreadsheet/grafik seperti Excel atau OpenOffice.
Dengan menggunakan program spreadsheet, bagilah 100 persen dengan masing-masing nilai "%T" untuk standar, lalu ambil log hasilnya. Perhitungan ini akan memberi Anda absorbansi. Jika Anda memasukkan rumus, program spreadsheet Anda akan melakukan perhitungan untuk Anda.
Contoh: Jika %T adalah 50.6, rumus yang Anda masukkan ke dalam program spreadsheet adalah sebagai berikut:
log (100/50.6)
Program spreadsheet akan melakukan aritmatika.
Lakukan hal yang sama untuk kelima nilai yang tidak diketahui/eksperimental.
Grafik nilai absorbansi untuk kelima standar, dengan konsentrasi pada sumbu x dan absorbansi pada sumbu y. Dengan menggunakan program spreadsheet, sesuaikan persamaan linier dengan grafik ini. Persamaan tersebut akan berbentuk y = mx + b. Sebagian besar program spreadsheet akan memiliki fungsi regresi linier. Konsultasikan manual pengguna untuk program spreadsheet Anda untuk detail tentang cara menggunakan fitur regresi linier.
Ambil persamaan untuk garis yang paling cocok dari program spreadsheet Anda dan selesaikan untuk y dengan mengurangkan b dari kedua sisi dan membagi kedua sisi dengan m. Hasilnya akan terlihat seperti berikut:
(y - b)/m = x
di mana b dan m adalah nilai yang ditemukan oleh program spreadsheet Anda.
Periksa nilai absorbansi Anda untuk yang tidak diketahui, dan pilih tiga yang berada dalam kisaran yang sama dengan standar. Gunakan ketiga nilai absorbansi ini untuk perhitungan Anda yang tersisa. Jika kelimanya berada dalam kisaran yang sama dengan standar, Anda dapat menggunakan kelimanya sebagai gantinya, tetapi Anda harus menggunakan setidaknya tiga.
Masukkan masing-masing dari tiga nilai absorbansi ke dalam persamaan Anda sebagai ganti y. Ingatlah bahwa persamaan Anda dalam bentuk berikut:
(y - b)/m = x
Jadi, Anda ingin memasukkan nilai absorbansi untuk setiap yang tidak diketahui ke dalam persamaan sebagai ganti y, lalu hitung x. Anda dapat menggunakan program spreadsheet untuk melakukan perhitungan ini untuk Anda dan membuatnya lebih cepat. Anda sekarang telah menghitung konsentrasi bahan kimia yang diinginkan dalam tiga senyawa tak dikenal yang diencerkan. Namun, larutan asli diencerkan untuk menyiapkan yang tidak diketahui ini, jadi Anda sekarang perlu bekerja mundur dan menghitung konsentrasi larutan asli berdasarkan faktor pengenceran.
Setiap sampel yang tidak diketahui yang Anda masukkan ke dalam spektrofotometer diencerkan dengan jumlah yang berbeda. Akibatnya, Anda sekarang harus membagi konsentrasi yang telah Anda hitung berdasarkan absorbansi untuk setiap pembacaan yang tidak diketahui dengan yang berikut:
Tidak diketahui 1: Bagi dengan 0,1 Tidak diketahui 2: Bagi dengan 0,2 Tidak diketahui 3: Bagi dengan 0,3 Tidak diketahui 4: Bagi dengan 0,4 Tidak diketahui 5: Bagi dengan 0,5
Ingat, bagaimanapun, bahwa angka-angka ini didasarkan pada asumsi Anda menggunakan pengenceran yang diuraikan di atas. Ingatlah untuk mengubah nilai ini jika Anda mengencerkan sampel Anda dengan jumlah yang berbeda.
Tambahkan hasil Anda bersama-sama, dan bagi dengan jumlah hasil. Ini akan memberi Anda rata-rata. Laporkan nomor ini sebagai temuan Anda untuk konsentrasi larutan asli.
Hal yang Anda Butuhkan
- Pensil
- Kertas
- Kalkulator
- Sarung tangan
- Kacamata
- Mantel lengan panjang
- Spektrofotometer
- kuvet kaca
- Parafilm
- Kimwipe
- Air deionisasi
- Solusi yang ingin Anda uji (konsentrasinya tidak diketahui)
- 1 larutan standar molar dari bahan kimia yang ada dalam larutan uji Anda
- Pipet & bohlam bertingkat
- Tabung reaksi & rak tabung reaksi
- Gelas kimia
Tips
Prosedur ini mungkin terdengar rumit, tetapi sebenarnya cukup mudah setelah Anda memulai. Coba tonton dua video di bawah bagian Sumber Daya untuk membiasakan diri Anda dengan prosedurnya.