Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) adalah teknik laboratorium yang digunakan untuk memisahkan dan mengidentifikasi senyawa. Ini adalah jenis kromatografi kolom yang bergantung pada polaritas senyawa yang berbeda dalam larutan untuk memisahkannya. HPLC berbeda dari kromatografi kolom standar karena menggunakan tekanan untuk memaksa larutan melalui kolom lebih cepat, dan karena itu menghasilkan hasil yang lebih cepat, dan terkadang lebih akurat. Tujuannya adalah untuk memisahkan senyawa dalam kolom dan mengeluarkannya secara terpisah.
Karena kecepatan HPLC dan ketergantungan pada polaritas senyawa yang berbeda, dua senyawa dengan struktur dan polaritas yang sama dapat keluar dari peralatan kromatografi pada saat yang sama atau hampir sama waktu. Ini dikenal sebagai koelusi. Koelusi membuat penentuan dengan tepat bagian mana dari campuran yang dielusi pada titik mana menjadi sulit.
HPLC biasanya menggunakan kolom kaca yang diisi dengan manik-manik yang terbuat dari bahan yang berbeda. Campuran dipaksa melalui kolom memiliki bahan kimia yang mengikat dengan kekuatan yang berbeda untuk manik-manik. Kekuatan pengikatan, yang tergantung pada kesamaan polaritas, menentukan berapa lama bahan kimia akan mengikat manik-manik sebelum dilepaskan. Beberapa senyawa terikat sangat kuat sehingga pada dasarnya tidak pernah dilepaskan dari butiran di kolom dan tidak pernah diukur dalam larutan yang keluar dari kolom.
Teknik pemisahan laboratorium yang umum melibatkan pengembangan pengujian, atau metode pemisahan, dan kemudian menerapkan pengujian tersebut untuk memisahkan senyawa individu dari larutan. Namun ini biasanya menghasilkan beberapa solusi yang juga perlu menjalani prosedur, yang mengarah pada peningkatan kompleksitas yang eksponensial. Meskipun HPLC seringkali dapat menyederhanakan dan mempercepat proses ini, biaya pengembangan peralatan HPLC dapat menjadi sangat besar. Mengembangkan peralatan HPLC, meskipun jauh lebih efisien, jauh lebih mahal daripada mengembangkan pengujian lain untuk memisahkan senyawa. Ini membuatnya tidak layak secara finansial untuk banyak laboratorium kecil milik swasta.
HPLC tidak hanya digunakan untuk memisahkan senyawa sederhana, tetapi juga digunakan untuk mengisolasi protein tertentu dari campuran seluler. Dalam hal ini manik-manik di kolom biasanya dilapisi dengan antibodi khusus untuk protein yang perlu Anda kumpulkan. Protein mengikat antibodi dan larutan yang tersisa dilewatkan melalui kolom, kemudian protein dilepaskan menggunakan larutan lain dan dikumpulkan. Ini membutuhkan teknisi yang sangat terampil untuk memantau kolom setiap saat dan memastikan bahwa proses berjalan persis seperti yang direncanakan.