Komponen Dasar HPLC

Kromatografi cair kinerja tinggi adalah teknik untuk analisis laboratorium campuran. Ini adalah jenis kromatografi yang efisien yang menggunakan tekanan tinggi, bukan hanya gravitasi, untuk mendorong sampel campuran melalui kolom. Sampel disuntikkan, kemudian pompa yang mengandung tekanan tinggi membantu memindahkan sampel di sepanjang kolom yang dikemas, di mana ia dipisahkan menjadi komponen individual. Pemisahan ini kemudian dianalisis oleh detektor untuk menghasilkan hasil.

Untuk disuntikkan ke dalam HPLC, sampel harus terlebih dahulu dilarutkan dalam pelarut cair polar, lebih disukai yang memiliki spektrum HPLC yang diketahui sehingga datanya dapat dibedakan dari sampel. Larutan cair yang mengandung sampel ditempatkan dalam instrumen dan dikirim ke kolom. Lokasi sebenarnya dari tempat suntikan tergantung pada merek instrumen. Dalam kebanyakan kasus, proses injeksi dilakukan secara otomatis, tetapi dalam beberapa kasus pekerja laboratorium harus menyuntikkan sampel menggunakan jarum suntik kecil.

Komponen pompa unit HPLC diperlukan karena memberikan tekanan yang mendorong sampel melalui kolom. Kekuatan pompa bervariasi, tetapi yang kuat dapat menghasilkan tekanan hingga 6.000 psi, atau pound per inci persegi, yang diterapkan setelah sampel disuntikkan. Hal ini memungkinkan sampel melewati kolom lebih cepat dan efisien daripada jika sampel menetes hanya dengan menggunakan gaya gravitasi.

Peningkatan kecepatan sampel melewati kolom dengan pompa memungkinkan untuk penggunaan jenis kolom yang berbeda dari yang digunakan dalam kromatografi cair sederhana. Bahan pengemas dalam kolom dapat memiliki ukuran partikel yang jauh lebih kecil, yang meningkatkan luas permukaan dan oleh karena itu membantu interaksi sampel dengan kolom. Sebagian besar kolom HPLC bekerja melalui polaritas. Sampel dilarutkan dalam pelarut polar, dan kolomnya sebagian besar terdiri dari hidrokarbon non-polar. Bagian kutub dari molekul sampel melewati kolom dengan sangat cepat karena mereka terutama berinteraksi dengan pelarut, sedangkan komponen non-polar sampel berlama-lama di kolom, membentuk interaksi lemah dengan kolom komponen. Oleh karena itu, komponen sampel keluar dari kolom secara berurutan dari yang paling polar ke yang paling non-polar.

Detektor juga bervariasi berdasarkan jenis instrumen HPLC yang digunakan. Namun, sebagian besar berfungsi dengan cara dasar yang sama. Sumber sinar ultraviolet menyinari komponen sampel yang terpisah saat keluar dari kolom. Sebagian besar senyawa organik menyerap sejumlah cahaya, sehingga saat melewati berkas cahaya yang diterapkan, detektor dapat menangkap berapa banyak cahaya yang diserap. Detektor juga mencatat waktu retensi komponen berdasarkan urutan saat komponen tersebut keluar dari kolom. Output ini kemudian dapat dianalisis berdasarkan area puncak untuk menentukan sifat yang tepat dari komponen sampel.