Tupai betina berkembang biak dengan cara kawin dan kemudian melahirkan anak hidup. Mereka mampu memulai proses kawin pada usia satu tahun. Musim kawin pertama dimulai pada akhir musim dingin, biasanya sekitar akhir Februari. Musim ini bisa berlangsung hingga Mei. Musim kawin kedua terjadi pada akhir musim semi dan berlangsung hingga akhir musim panas. Kebanyakan spesies tupai memiliki dua tandu; satu di akhir musim semi dan satu di akhir musim panas. Beberapa spesies hanya menghasilkan sedikit sekali dalam setahun. Bayi tupai disebut anak kucing.
Tupai betina mengeluarkan aroma kuat yang dapat dideteksi oleh tupai jantan. Setelah tupai jantan mencium bau betina, dia akan mengejarnya dengan kecepatan tinggi melalui pepohonan. Dia juga akan menampar kulit pohon dengan keras dengan cakarnya. Jika lebih dari satu pejantan mengejar satu betina, pejantan akan sering juga mencoba mengejar satu sama lain. Ini menghasilkan akrobat yang luar biasa melalui pepohonan. Betina akan memilih jantan terkuat untuk dikawinkan. Dia akan dapat mengenalinya sejak hari itu dan akan bersusah payah untuk tidak pernah kawin dengannya lagi. Setelah kawin, tupai jantan pergi untuk selamanya. Dia tidak ada hubungannya dengan membesarkan anak-anak kucing.
Rata-rata kotoran tupai terdiri dari dua hingga lima anak kucing. Masa kehamilan sekitar enam minggu, meskipun beberapa spesies tupai memiliki masa kehamilan sesingkat empat minggu dan yang lain selama delapan minggu, seperti tupai abu-abu dan rubah.
Tupai bayi, atau anak kucing, kecil saat lahir. Beratnya sekitar satu ons dan panjangnya sekitar satu inci. Mereka tidak berbulu, tanpa gigi, dan hampir buta selama satu sampai dua bulan pertama kehidupan. Namun, mereka tumbuh dengan cepat dan biasanya benar-benar disapih pada usia sepuluh minggu. Pada saat mereka berusia empat bulan, kebanyakan bayi tupai telah meninggalkan sarang induknya untuk selamanya.