A molekuláris biológiában a puffer megválasztása és előkészítése a különböző DNS-izolációs lépésekhez megfelelő lehet a különbség a fehérje expresszióra való áttérés vagy egy másik maxi-prep kit megnyitása között a kezdéshez felett. Döntő fontosságuk ellenére a puffer receptek gyakran csak ilyenek - a különféle összetevők magyarázata és indoklása nélkül írt receptek. Az egyik ilyen puffer a glükóz-trisz-EDTA vagy GTE puffer.
Mire használják a GTE-t?
A GTE-t a baktériumsejt-pelletek újraszuszpendálására használják a sejtek lizálása (kinyitása) és a benne lévő plazmid DNS összegyűjtése előtt. A sejtmembránokat lágyító lizozimot gyakran adnak a GTE pufferhez. A jó DNS-hozam eléréséhez kulcsfontosságú az egész sejtek homogén szuszpenziójának elérése ebben a lépésben annak érdekében, hogy a később hozzáadott lízisoldat az összes sejthez eljusson. A GTE erre készült, miközben stabil környezetet biztosít a DNS számára is.
Glükóz az ozmolaritásért
50 millimól (millimoláris) glükózcukrot adunk a GTE pufferbe az ozmolaritás fenntartása érdekében, ahol az oldott anyag koncentrációja a sejteken kívül közel van a sejteken belüli koncentrációhoz. Ez megakadályozza a korai sejtlízist, amely alacsonyabb DNS-hozamot okozhat az aggregáció és a lebomlás miatt. A puffer egyéb komponensei szintén hozzájárulnak az oldat ozmolaritásához, de a glükóz, mivel nem elektrolit, jó választás, mert nem zavarja az oldat pufferjét tulajdonságait.
Tris a pH-stabilitás érdekében
A Tris a trisz (hidroxi-metil) -amino-metán rövid neve, amely nagyon gyakori pH-puffer. GTE puffer esetén a savas sót (Tris-HCl) 25 mM koncentrációban adjuk a pufferhez. Ez az oldat pH-ját közel fiziológiás 8,0 értéken tartja, ideális pH-értéket biztosítva a plazmid DNS savas hidrolízisének (lebomlásának) és a többi sejtkomponens nemkívánatos mellékreakcióinak megakadályozásához.
Az EDTA megakadályozza a DNS lebomlását
Az EDTA vagy etilén-diamin-tetraecetsav megfogja vagy "kelátozza" a fémionokat az oldatból, megakadályozva, hogy részt vegyenek a nem kívánt mellékreakciókban. GTE pufferben EDTA-t adunk 10 mM koncentrációban. Elsődleges célja a pufferben a szabad cink, magnézium és kalcium felkerekítése, megakadályozva ezzel a DNS lebontását bizonyos utakban, amelyekhez ezek a fémek szükségesek.
Néhány fontos tipp
Tartsa hidegben a GTE puffert, és készítse el kis mennyiségben, hogy megakadályozza a nem kívánt baktériumok szaporodását benne. A cukor és az ellenőrzött pH nagyszerű táptalajt eredményez. Mindig tisztított vizet használjon. A csapvíz feleslegben tartalmazhat fémionokat a csövekből, ami felülmúlhatja az EDTA megfogási képességét. Ha arra gyanakszik, hogy zavaró RNS van a mintájában, a probléma kiküszöbölése érdekében adjon 100 mikrogramm / milliliter RNáz A-t a GTE pufferjéhez.