A molekuláris klónozás egy általános biotechnológiai módszer, amelyet minden hallgatónak és kutatónak ismernie kell. Molekuláris klónozás egy restrikciós enzim nevű enzim segítségével, hogy az emberi DNS-t olyan fragmentumokra vágja, amelyek ezt követően beilleszthetők egy baktérium sejt plazmid DNS-be. A restrikciós enzimek kettévágják a DNS-t. A restrikciós enzimtől függően a vágás ragadós vagy tompa véget eredményezhet. A ragadós végek sokkal hasznosabbak a molekuláris klónozásban, mert biztosítják, hogy az emberi DNS-fragmens a helyes irányba kerüljön be a plazmidba. A ligációs folyamat vagy a DNS-fragmensek összeolvadása kevesebb DNS-t igényel, ha a DNS-nek ragacsos végei vannak. Végül, több ragadós vég-restrikciós enzim ugyanazt a ragacsos véget képes előállítani, annak ellenére, hogy mindegyik enzim különböző restrikciós szekvenciát ismer fel. Ez megnöveli annak valószínűségét, hogy a kívánt DNS-régiót ragadós végenzimekkel lehet kivágni.
Korlátozó enzimek és korlátozó helyek
A restrikciós enzimek olyan enzimek, amelyek elvágják a kettős szálú DNS specifikus szekvenciáit, és a DNS-t ezen a szekvencián kettévágják. A felismert szekvenciát restrikciós helynek nevezzük. A restrikciós enzimeket azért nevezzük endonukleázoknak, mert kettős szálú DNS-t vágnak le, vagyis a DNS normálisan létezik, olyan helyeken, amelyek a DNS végei között vannak. Több mint 90 különböző restrikciós enzim létezik. Mindegyik különálló restrikciós helyet ismer fel. A restrikciós enzimek 5000-szer hatékonyabban hasítják a megfelelő restrikciós helyeiket, mint más helyek, amelyeket nem ismernek fel.
A helyes tájékozódás
A restrikciós enzimek két általános osztályba sorolhatók. Vagy ragadós, vagy tompa végekre vágják a DNS-t. A ragadós végén egy rövid nukleotidtartomány, a DNS építőköve van, amely párosítatlan. Ezt a párosítatlan régiót túlnyúlásnak nevezzük. A túlnyúlás állítólag ragacsos, mert egy másik ragadós véget akar és párosítani fog, amelynek komplementer túlnyúlási sorrendje van. A ragadós végek olyanok, mint a rég elveszett ikrek, akik találkozásuk után szorosan át akarják ölelni egymást. Másrészt a tompa végek nem ragadnak, mert az összes nukleotid már párosul a DNS két szála között. A ragadós végek előnye, hogy az emberi DNS-fragmens csak egy irányban illeszkedhet egy baktérium-plazmidba. Ezzel szemben, ha az emberi DNS-nek és a bakteriális plazmidnak is tompa vége van, akkor az emberi DNS fej-farok vagy farok-fej között beilleszthető a plazmidba.
A ragadós végek ligálása kevesebb DNS-t igényel
Bár a botvégű DNS-nek könnyebb megtalálni egymást „ragadóssága” miatt, sem a ragacsos, sem a tompa végek nem tudnak összeolvadni egy folyamatos DNS-részdé. A teljesen összekapcsolt, folytonos DNS-rész kialakulásához egy ligáz nevű enzimre van szükség. A ligázok a ragadós vagy tompa végeken kötik össze a nukleotidok gerincét, így egy folyamatos nukleotidláncot eredményeznek. Mivel a ragadós végek egymás iránti vonzódásuk miatt gyorsabban megtalálják egymást, a ligálási folyamathoz kevesebb emberi DNS és kevesebb plazmid DNS szükséges. A DNS és a plazmid tompa végei kevésbé valószínű, hogy egymásra találnak, ezért a tompa végek ligálása megköveteli, hogy több DNS kerüljön a kémcsőbe.
Különböző enzimek ugyanazt a ragacsos véget adhatják
A restrikciós helyek az egész organizmus genomjában találhatók, de nincsenek egyenletesen elosztva. A plazmidokban úgy lehet tervezni, hogy közvetlenül egymás mellett helyezkedjenek el. Azoknak a tudósoknak, akik kivágni akarják az emberi DNS egy töredékét az emberi genomból, meg kell találniuk a restrikciós helyeket, amelyek a fragmens régiója előtt és mögött találhatók. Amellett, hogy biztosítják a DNS-fragmens helyes irányba történő beillesztését, a különböző ragadós vég enzimek ugyanazt a ragacsos véget hozhatják létre, annak ellenére, hogy különböző restrikciós szekvenciákat ismernek fel. Például a BamHI, a BglII és a Sau3A különböző felismerési szekvenciákkal rendelkezik, de ugyanaz a GATC ragadós vége van. Ez növeli annak valószínűségét, hogy lesznek ragadós vég-restrikciós helyek, amelyek az érdeklődő emberi génjét kísérik.