Lančana reakcija polimeraze, ili PCR, tehnika je koja fotokopira jedan fragment DNA u mnogo fragmenata - eksponencijalno mnogo. Prvi je korak u PCR-u zagrijavanje DNA tako da ona denaturira ili se istopi u pojedinačne niti. Građa DNA slična je ljestvama užeta u kojima su prečke užad s magnetskim krajevima. Magneti se spajaju i tvore prečke, nazvane osnovni parovi, i na taj se način odupru razdvajanju. Svaki se fragment DNA topi u pojedinačne niti pri različitim temperaturama. Razumijevanje kako strukturu DNA drže zajedno pojedini dijelovi DNA dat će uvid u to zašto različiti fragmenti DNA tope se na različitim temperaturama i zašto su u početku potrebne tako visoke temperature mjesto.
Topljenje! Topljenje!
Prvi korak PCR-a je rastopiti DNA tako da se dvolančana DNA odvoji u jednolančanu DNA. Za DNA sisavaca, ovaj prvi korak obično uključuje toplinu od približno 95 Celzijevih stupnjeva (oko 200 Fahrenheita). Pri ovoj temperaturi, vodikove veze između A-T i G-C baznih parova ili prečke u ljestvici DNA raspadaju se, raspakirajući dvolančanu DNA. Međutim, temperatura nije dovoljno vruća da slomi fosfatno-šećernu okosnicu koja tvori pojedinačne niti ili polove ljestvi. Potpuno razdvajanje pojedinačnih lanaca priprema ih za drugi korak PCR-a, koji se hladi kako bi se omogućilo da kratki fragmenti DNA, nazvani početnici, vežu pojedinačne lance.
Magnetski zatvarači
Jedan od razloga zbog kojeg se DNA zagrijava na visoku temperaturu od 95 stupnjeva Celzijevih jest taj što što je duža nit DNA dvostruka, to više želi ostati zajedno. Duljina DNA jedan je od čimbenika koji utječe na točku topljenja odabranu za PCR na tom dijelu DNA. Parovi baza A-T i G-C u dvolančanoj DNA vezi međusobno drže dvolančanu strukturu zajedno. Što se više uzastopnih baznih parova između dvije jednostruke nitke veže, to se njihovi susjedi također žele povezati i jača privlačnost između dvije niti. To je poput zatvarača izrađenog od malih magneta. Kad zatvorite patentni zatvarač, magneti će prirodno htjeti zakopčati se i ostati patentni zatvarač.
Jači magneti čvrsto se lijepe
Još jedan faktor koji utječe na odabir temperature topljenja za vaš DNA fragment koji vas zanima je količina parova baza G-C prisutnih u tom fragmentu. Svaki osnovni par je poput dva mini-magneta koji privlače. Par izrađen od G i C mnogo je jače privlačan od para A i T. Stoga će komad DNA koji ima više G-C parova od drugog fragmenta zahtijevati višu temperaturu prije topljenja u pojedinačne niti. DNA prirodno apsorbira ultraljubičasto svjetlo - točnije na valnoj duljini od 260 nanometara - a jednolančana DNA apsorbira više svjetlosti nego dvolančana DNA. Dakle, mjerenje količine apsorbirane svjetlosti način je mjerenja koliko se vaša dvolančana DNA stopila u pojedinačne niti. Učinak "magnetskog patentnog zatvarača" parova baza G-C i A-T uzrokuje grafikon apsorpcije svjetlosti dvolančana DNA zacrtana protiv povećanja temperature da bude sigmoidna, oblika S, a ne a ravna crta. Krivulja S predstavlja otpor timskog rada koji bazni parovi vrše protiv vrućine jer se ne žele razdvajati.
Točka na pola puta
Temperatura na kojoj se duljina DNA topi u pojedinačne niti naziva se njenom temperaturom topljenja, koja se označava kraticom "Tm". To ukazuje na temperaturu na kojoj se polovica DNA u otopini istopila u jednostruke niti, a druga polovica je još uvijek u dvolančanim oblik. Temperatura topljenja različita je za svaki fragment DNA. DNA sisavaca ima sadržaj G-C od 40%, što znači da je preostalih 60% parova baza As i Ts. Sadržaj G-C od 40% uzrokuje da se DNA sisavaca topi na 87 Celzijevih stupnjeva (oko 189 Fahrenheita). Zbog toga je prvi korak PCR-a na DNA sisavca zagrijavanje na 94 Celzijeva stupnja (201 Fahrenheita). Samo sedam stupnjeva vruće od temperature topljenja i sve će se dvostruke niti potpuno rastopiti u pojedinačne niti.