Gel elektroforeza je tehnika u kojoj se biološke molekule međusobno odvajaju i identificiraju u biološkim istraživanjima ili medicinskoj dijagnostici. Od svog razvoja 1970-ih, ove su tehnike bile neprocjenjive u identificiranju gena (DNA) i genskih proizvoda (RNA i proteini) od istraživačkog interesa. Posljednjih godina pojavile su se novije tehnike koje daju veću specifičnost i detalje o onome što se događa u živim sustavima. Iako ove tehnike nisu zamijenile tehnike elektroforeze, a napredne manipulacije mogu proširiti održivost tehnike, važno je shvatiti što elektroforeza u gelu može, a što ne može učiniti.
Elektroforeza ima ograničenu analizu uzoraka
Elektroforeza je specifična za bilo koje tkivo koje ste uzeli. Na primjer, ako pokrenete Southern blot (vrstu elektroforeze) na brisu obraza, gledate gene iz epitelnih stanica vašeg obraza i nigdje drugdje u tijelu. Ponekad to može biti korisno, ali istraživače često zanimaju rašireniji učinci.
Tehnike poput hibridizacije in situ (ISH) mogu uzeti dio tkiva i analizirati ekspresiju gena na svakom malom području tog uzorka. Dakle, istraživači mogu promatrati svako područje mozga u uzorku s ISH, dok tehnike elektroforeze mogu promatrati samo nekoliko područja odjednom.
Mjerenja elektroforeze nisu precizna
Elektroforeza u gelu može učinkovito razdvojiti slične proteine s različitim težinama (to je tehnika koja se naziva Western blotting). Može ih preciznije razdvojiti tehnikom poznatom kao 2d elektroforeza; to je uobičajeno u proteomiki.
Nažalost, sva mjerenja izvedena ovom tehnikom u najboljem su slučaju kvantitativna. Da bi se dobila precizna masa (težina) proteina, mora se primijeniti masena spektroskopija nakon što je protein pročišćen elektroforezom. Nadalje, usporedba relativnih količina različitih molekula oslanja se na gustoću pojasa (tamnost) različitih mjesta na gelu. Ova metoda ima određeni stupanj pogreške, a uzorci se obično pokreću više puta kako bi se dobili čisti rezultati.
Potreban je značajan početni uzorak
Elektroforeza je tehnika izoliranja i vizualnog prepoznavanja različitih biomolekula. To se postiže propuštanjem električne struje kroz gel za odvajanje nabijenih molekula različitih težina. Ako molekula koja vas zanima nije dovoljno česta, njezin će pojas biti gotovo nevidljiv i teško mjerljiv.
DNA i RNA se mogu malo pojačati prije pokretanja elektroforeze, ali nije praktično to raditi s proteinima. Stoga je za provođenje ovih testova potreban velik uzorak tkiva. To može ograničiti korisnost tehnike, posebno u medicinskoj analizi. Gotovo je nemoguće izvršiti elektroforezu na uzorcima iz jedne stanice; protočna citometrija i imunohistokemija češće se koriste za procjenu stanične ekspresije proteina. Tehnika zvana PCR izvrsna je u preciznom mjerenju malenih količina RNA.
Mogu se vizualizirati samo određene molekule
Elektroforeza izvrsno razdvaja i identificira srednje do velike biomolekule. Međutim, mnoge molekule koje istraživači žele pogledati manje su; mali hormoni, neurotransmiteri i ioni ne mogu se izmjeriti elektroforezom. To je iz dva razloga: oni ne reagiraju pravilno s pripravkom za elektroforezu (obično tehnika SDS STRANICA), a čak i da jesu, premale su da bi se pravilno odvojile i izletjele bi s dna gel. Te se molekule umjesto toga mjere tehnikama kao što su RIAA (radio imunološki testovi) i ELISA (enzimski povezani imunosorbant test).
Elektroforeza je slabe propusnosti
Gel elektroforeza je općenito niske propusnosti, što znači da ne stvara podatke posebno brzo. Kontrastna elektroforeza, gdje istovremeno možete pogledati malu šačicu molekula RNA, s PCR (lančana reakcija polimeraze), koja istovremeno može procijeniti tisuće uzoraka. Slično tome, protočna citometrija može mjeriti tisuće pojedinačnih stanica i učiniti složenim korelacije, dok elektroforeza masno promatra stanice i ne može ih stvoriti tako fino diskriminacije. PCR i protočna citometrija predstavljaju masovno paralelne, odnosno serijske procese, i oboje daleko nadmašuju mogućnosti elektroforeze da generira podatke o istraživanju.