DNA
Deoksiribonukleinska kiselina i proteini. DNA je organizirana u jedinice nazvane geni, od kojih svaka kodira određenu sekvencu RNA ili proteina. Geni se proučavaju kako bi se naučilo o biološkoj strukturi i funkciji, evoluciji, bolestima i mnogim drugim aspektima živih sustava. Da bi se geni detaljno proučavali, DNA se mora izolirati i pročistiti iz stanica koje nas zanimaju.
Ekstrakcija DNA
Iako se DNK iz jedne stanice može izvući i proučiti, to nije dovoljno za vidjeti golim okom. Da biste dobili količinu dovoljnu za namotavanje, što više stanica morate raditi, to bolje (mnogi milijuni).
Točni protokoli znatno se razlikuju zbog jedinstvenih karakteristika specifičnih uzoraka, ali opći koraci su homogenizacija, liza, probava, odvajanje i prikupljanje. Postupak je najbolje provesti u maloj (ovisno o veličini uzorka) staklenoj ili plastičnoj cijevi.
Uzorak je obično pomiješan ili samljeven kako bi se stanice temeljito odvojile jedna od druge. To čini stanične sastojke dostupnijima reagensima koji slijede. Zatim se homogenatu doda deterdžent ili enzimi za liziranje staničnih membrana (i nuklearnih membrana ako su stanice eukariotske) radi oslobađanja DNA. U ovom trenutku DNA je okružena proteinima, lipidima, ugljikohidratima, svime ostalim što je bilo u stanicama.
Daljnja enzimatska probava može biti potrebna kako bi se proteini razgradili kako se ne bi vezali za DNA i ometali njezino prikupljanje. DNA se odvaja od ostatka staničnog sadržaja dodavanjem hladnog, čistog, etilnog ili izopropilnog alkohola. DNA nije topljiva u tim alkoholima, pa će se kondenzirati kako bi pokušala minimalizirati svoj kontakt s alkoholom. Kondenzirana DNA tada se sakuplja, obično centrifugiranjem ili namotavanjem.
DNA spooling
Prikupljanje DNA namotavanjem učinkovito je kada se u postupku ekstrakcije dobije velika količina DNA. Također je izvrsna demonstracijska metoda jer se jasno vidi impresivan splet čiste DNA.
Da bi se namotala DNA, korak odvajanja mora se provesti pažljivo. Ako prethodno nije dodana smjesa reagensa za lizu, otopini se mora dodati koncentrirana otopina soli (natrijev klorid) prije koraka dodavanja alkohola. Hladni alkohol polako se ulijeva sa strane epruvete kako bi se stvorio sloj na vrhu vodene otopine, izbjegavajući miješanje. Ako se pravilno izvede, alkohol će stvoriti vlastiti sloj na vrhu slanog sloja. Zatim dolazi do namotavanja.
Da biste sakupili DNA iz slanog sloja, pažljivo stavite staklenu šipku za miješanje kroz sloj alkohola dok ne dodirne dno cijevi. Polako vrtite štap između prstiju, dok promatrate sučelje između dva sloja. Ako je prisutno dovoljno DNK, skupit će se na međupovršini između slojeva i oblikovati mliječno prozirnu masu. Zavrtite šipku kako biste omotali DNK oko nje (to je dio za namotavanje) i izvukli je iz cijevi. DNA se može prenijeti u drugu epruvetu čistog alkohola radi skladištenja ili daljnje analize.