Glavni razlog zbog kojeg mrljete uzorak prije nego što ga stavite pod mikroskop jest bolji pogled, ali bojanje čini mnogo više od pukog isticanja obrisa stanica. Neke mrlje mogu prodrijeti kroz stanične zidove i istaknuti stanične komponente, a to može pomoći znanstvenicima da vizualiziraju metaboličke procese. Mrlje također pomažu razlikovati žive stanice od mrtvih. Štoviše, bojanje omogućuje znanstvenicima da broje broj stanica određenog tipa unutar određene biomase. Postoji dvadeset ili više različitih vrsta mrlja, a svaka ima svoju svrhu.
TL; DR (predugo; Nisam pročitao)
Glavna svrha bojenja je istaknuti stanice i dijelove stanica. Postoji preko 20 različitih vrsta mrlja, a vrsta mrlja koje koristite ovisi o tome što tražite.
Vrste mrlja
Izbor mrlje ovisi o tome što tražite. Nisu sve mrlje prikladne za žive stanice, ali one uključuju Bismarck smeđu, toluensko crvenu, Nilsku plavu i Nilsku crvenu, te određene fluorescentne lampice koje se koriste za isticanje DNA. Neke mrlje ističu spore, neke otkrivaju lipide i proteine, a neke mijenjaju boju u prisutnosti škroba. Svrha pregleda određuje najbolju vrstu mrlja za upotrebu. Na primjer, liječnik koji provodi PAP bris koristio bi Eosin Y. Riječ je o kiseloj fluorescentnoj boji koja postaje crvena kada kontaktira crvene krvne stanice, citoplazmu i stanične membrane. Također se koristi za ispitivanje krvne srži.
U nekim slučajevima istražitelj može upotrijebiti više od jedne mrlje. Na primjer, hematoksilin je mrlja koja jezgre stanica pretvara u plavu. Kada se koristi zajedno s eozinom, koji druge dijelove stanice pretvara u crveno ili ružičasto, pruža jači kontrast i olakšava razlikovanje jezgri. PAP mrlje i uzorke krvne srži lakše je ispitati kada se ove dvije mrlje koriste zajedno.
Gramova mrlja: Bolnički radnici koriste Gramovu mrlju kako bi identificirali štetne bakterije. Ovo je zapravo niz bojila koja imaju različit učinak na različite vrste bakterija i daju liječnicima važan dijagnostički alat. Gramova mrlja trodjelni je postupak. U prvu se dodaje Huckerova kristalna ljubičica koja svim bakterijama boji jednoličnu ljubičastu boju. U sljedećoj fazi dodaje se jodna mrlja zbog čega se boja lijepi za Gram-pozitivne stanice, a to su prvenstveno Staphylococcus i Streptococcus. Mrlja se ispire, a gram-pozitivne stanice imaju izrazitu ljubičastu boju; zatim se uvodi treća mrlja, Safranine O, kako bi se pojačao kontrast između gram-negativnih bakterija i ostatka materijala na staklu.
Postupak bojenja
Kada pripremate uzorak na dijapozitivu, možete ga montirati na suho ili mokro, možete ga narezati na tanki dio ili možete razmazati. Kad se koristi mrlja, uobičajeni postupak je mokro montiranje uzorka, što znači staviti kap vode na tobogan, postaviti uzorak u vodu i prekriti ga pokrovnom pločicom. Zatim kapaljkom nanesite mrlju na kut stakala i dopustite da je kapilarnim djelovanjem povučete prema uzorku. Pomaže stavljanje papirnatog ručnika na suprotnu stranu tobogana kako bi privukao vodu. Nakon što se mrlja raširi po cijelom dijapozitivu, uzorak je spreman za ispitivanje.