Elektroforeza u gelu je često korištena laboratorijska tehnika s mnogim praktičnim primjenama, uključujući DNK otiske prstiju i sekvenciranje genoma. Proces uključuje razdvajanje DNK fragmenti koji koriste električnu struju dok prate brzinu molekularnog kretanja kroz filtrirajući gel.
Dodavanje plave ili narančaste boje za praćenje bezbojnim uzorcima DNA omogućuje vam da vidite svoj uzorak i dobijete informacije o tome kako se molekule DNA kreću tijekom elektroforeze. Identifikacija se temelji na veličini DNA traka na gelu nakon migracije molekula.
Kako djeluje elektroforeza u gelu
Elektroforeza u gelu izvlači fragmente DNA kroz gel pomoću električne struje kako bi izolirao i identificirao molekule DNA prema veličini i električnom naboju. Gel se često izrađuje sa agarozni prah - polisaharid ekstrahiran iz alge.
Agaroza se dodaje puferskoj otopini vode i soli, a smjesa se zagrijava i hladi kako bi nastao porozni gel koji će tijekom postupka elektroforeze djelovati kao filtrirajuća matrica. Zatim se gel stavi u jedinicu za elektroforezu i pokrije puferskom otopinom koja provodi struja.
Otopine koje sadrže DNA i boje za punjenje pipetiraju se u male jažice u gelu koje se moraju napraviti tijekom pripreme gela. Bojepomoći tijasno vidjeti uzorak koje dodajete u jamice s gelom smještene u blizini negativne elektrode jedinice za elektroforezu.
Pozitivna elektroda nalazi se na suprotnom kraju. Poznati standard fragmenata DNA smješten je u prvu jažicu koja će stvoriti ljestvicu DNA traka za usporedbu i identifikaciju.
Fosfatna okosnica molekula DNA daje DNK negativan naboj. Suprotnosti se privlače, pa prema tome molekule DNA privlače pozitivnu elektrodu i počinju se kretati ili "migrirati" kad se uključi električna struja.
Fragmenti DNA manje veličine putuju brže od većih fragmenata jer nailaze na manji otpor dok migriraju kroz poroznu matricu gela. Fragmenti DNA slične veličine čine gelove trake DNA.
Učitavanje svrhe i važnosti bojila
DNA je bezbojna, pa dodavanje praćenje boja na uzorak vam pomaže odrediti brzinu kretanja različitih molekula proteina u gelu tijekom elektroforeze. Primjeri punjenja boja koje se kreću s uzorkom DNA uključuju bromofenolplava i ksilen cijanola.
Odabrana boja ne smije biti reaktivna ili mijenjati DNA. Bromofenol plava je boja koja se koristi za praćenje manjih DNA lanaca koji sadrže oko 400 baznih parova, dok je ksilen cijanol bolji za veće DNA lance s do 8000 baznih parova. Odabrana boja ne smije biti reaktivna ili mijenjati DNA.
Uloga glicerola u elektroforezi u agaroznom gelu
Kada pripremate svoj uzorak DNK za elektroforeza, morat ćete dodati glicerol i vodu zajedno s bojama za punjenje. Glicerol je teška sirupasta tvar koja daje veću gustoću uzorku DNK prije nego što se umetne u jažice na jednom kraju gelnog lista.
Bez glicerola, DNK uzorak bi se raspršio, umjesto da bi potonuo i formirao sloj u jažici kao što bi to trebao činiti za stvaranje ljestvice DNA.
Praćenje boje na SDS STRANICI
Elektroforeza u natrijevom dodecil sulfatu u poliakrilamidnom gelu (SDS PAGE) tehnika je prikladna za odvajanje proteina i aminokiselina, koji su manji i složeniji od linearnih molekula DNA. Poliakrilamid (SDS PAGE gel) koristi se umjesto agaroznog gela za elektroforezu.
Bromofenol plavo (BPB) dodaje se u pufer za uzorke kao a praćenje boje koji se kreće u istom smjeru razdvajanja bjelančevina i razgraničava njihov prednji rub.
Uloga boje koja veže DNA
Boja koja veže DNA poput narančasto obojene etidijev bromid može se dodati u gel ili u pufer za elektroforezu. Kao što i samo ime govori, boja se veže za molekulu DNA.
Pri rukovanju ovom mutagenom bojom mora se biti vrlo oprezan jer se ona može vezati za DNA u stanicama kože. Za razliku od boja za praćenje, etidij bromid fluorescira vedro ispod UV svjetlost, čineći DNK trake vidljivima.