पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन में पहला कदम क्या है?

पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन, या पीसीआर, एक ऐसी तकनीक है जो डीएनए के एक टुकड़े को कई टुकड़ों में फोटोकॉपी करती है - घातीय रूप से कई। पीसीआर में पहला कदम डीएनए को गर्म करना है ताकि यह विकृत हो जाए, या एकल स्ट्रैंड में पिघल जाए। डीएनए की संरचना एक रस्सी की सीढ़ी की तरह होती है जिसमें चुंबकीय सिरों वाली रस्सियाँ होती हैं। चुम्बक रूंग्स बनाने के लिए जुड़ते हैं, जिन्हें बेस पेयर कहा जाता है, और इस प्रकार अलग होने का विरोध करते हैं। डीएनए का प्रत्येक टुकड़ा अलग-अलग तापमान पर एकल स्ट्रैंड में पिघल जाता है। यह समझना कि डीएनए के अलग-अलग हिस्सों द्वारा डीएनए की संरचना को एक साथ कैसे रखा जाता है, यह इस बात की जानकारी देगा कि क्यों अलग-अलग डीएनए टुकड़े अलग-अलग तापमान पर पिघलते हैं और पहले में इतने उच्च तापमान की आवश्यकता क्यों होती है जगह।

पीसीआर का पहला कदम डीएनए को पिघलाना है ताकि डबल स्ट्रैंडेड डीएनए सिंगल स्ट्रैंडेड डीएनए में अलग हो जाए। स्तनधारी डीएनए के लिए, इस पहले चरण में आमतौर पर लगभग 95 डिग्री सेल्सियस (लगभग 200 फ़ारेनहाइट) की गर्मी शामिल होती है। इस तापमान पर ए-टी और जी-सी आधार जोड़े के बीच हाइड्रोजन बांड, या डीएनए सीढ़ी में चलते हैं, डबल-फंसे डीएनए को खोलकर अलग हो जाते हैं। हालांकि, तापमान इतना गर्म नहीं है कि फॉस्फेट-चीनी रीढ़ की हड्डी को तोड़ सके जो कि एकल किस्में, या सीढ़ी के ध्रुवों का निर्माण करती है। सिंगल स्ट्रैंड्स का पूर्ण पृथक्करण उन्हें पीसीआर के दूसरे चरण के लिए तैयार करता है, जो कि छोटे डीएनए अंशों, जिन्हें प्राइमर कहा जाता है, को सिंगल स्ट्रैंड्स को बांधने की अनुमति देने के लिए ठंडा कर रहा है।

डीएनए को 95 डिग्री सेल्सियस के उच्च तापमान पर गर्म करने का एक कारण यह है कि डीएनए डबल स्ट्रैंड जितना लंबा होता है, उतना ही वह एक साथ रहना चाहता है। डीएनए की लंबाई एक ऐसा कारक है जो डीएनए के उस टुकड़े पर पीसीआर के लिए चुने गए गलनांक को प्रभावित करता है। ए-टी और जी-सी बेस जोड़े डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए बॉन्ड में एक-दूसरे के साथ डबल-स्ट्रैंड संरचना को एक साथ रखने के लिए। दो सिंगल-स्ट्रैंड्स के बीच जितने अधिक बेस पेयर बंधते हैं, उतना ही उनके पड़ोसी भी बंधना चाहते हैं, और दो स्ट्रैंड्स के बीच आकर्षण उतना ही मजबूत होता जाता है। यह छोटे चुम्बकों से बने ज़िप की तरह है। जैसे ही आप ज़िप बंद करते हैं, चुम्बक स्वाभाविक रूप से ज़िप करना और ज़िपित रहना चाहेंगे।

एक अन्य कारक जो प्रभावित करता है कि आपके डीएनए टुकड़े के लिए कौन सा पिघलने का तापमान चुनना है, उस टुकड़े में मौजूद जी-सी बेस जोड़े की मात्रा है। प्रत्येक आधार जोड़ी दो मिनी-चुंबकों की तरह होती है जो आकर्षित करती हैं। G और C से बना एक जोड़ा A और T की जोड़ी की तुलना में बहुत अधिक आकर्षित होता है। इस प्रकार डीएनए का एक टुकड़ा जिसमें दूसरे टुकड़े की तुलना में अधिक जी-सी जोड़े होते हैं, एकल स्ट्रैंड में पिघलने से पहले उच्च तापमान की आवश्यकता होगी। डीएनए स्वाभाविक रूप से पराबैंगनी प्रकाश को अवशोषित करता है - 260 नैनोमीटर तरंग दैर्ध्य पर, सटीक होने के लिए - और एकल-फंसे डीएनए डबल-फंसे डीएनए की तुलना में अधिक प्रकाश को अवशोषित करता है। तो अवशोषित प्रकाश की मात्रा को मापना यह मापने का एक तरीका है कि आपका डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए सिंगल स्ट्रैंड में कितना पिघल गया है। G-C और A-T आधार युग्मों का "चुंबकीय ज़िप" प्रभाव है जो. के प्रकाश अवशोषण के ग्राफ का कारण बनता है डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए को सिग्मॉइडल होने के लिए तापमान में वृद्धि के खिलाफ प्लॉट किया गया, जिसका आकार एस जैसा था, न कि ए सीधी रेखा। S का वक्र टीमवर्क प्रतिरोध का प्रतिनिधित्व करता है जो आधार जोड़े गर्मी के खिलाफ लगाते हैं क्योंकि वे अलग नहीं होना चाहते हैं।

जिस तापमान पर डीएनए की लंबाई एकल स्ट्रैंड में पिघलती है, उसे इसका गलनांक कहा जाता है, जिसे संक्षिप्त नाम "Tm" से दर्शाया जाता है। यह उस तापमान को इंगित करता है जिस पर एक विलयन में आधा डीएनए एकल स्ट्रैंड में पिघल गया है और दूसरा आधा अभी भी डबल-स्ट्रैंड में है प्रपत्र। डीएनए के प्रत्येक टुकड़े के लिए पिघलने का तापमान अलग होता है। स्तनधारी डीएनए में ४०% की जी-सी सामग्री होती है, जिसका अर्थ है कि शेष ६०% आधार जोड़े As और Ts हैं। इसकी 40% जी-सी सामग्री स्तनधारी डीएनए को 87 डिग्री सेल्सियस (लगभग 189 फ़ारेनहाइट) पर पिघला देती है। यही कारण है कि स्तनधारी डीएनए पर पीसीआर का पहला कदम इसे 94 डिग्री सेल्सियस (201 फारेनहाइट) तक गर्म करना है। पिघलने के तापमान से सिर्फ सात डिग्री अधिक गर्म और सभी डबल स्ट्रैंड पूरी तरह से सिंगल स्ट्रैंड में पिघल जाएंगे।