जेल वैद्युतकणसंचलन डीएनए फिंगरप्रिंटिंग और जीनोम अनुक्रमण सहित कई व्यावहारिक अनुप्रयोगों के साथ आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली प्रयोगशाला तकनीक है। प्रक्रिया में अलग करना शामिल है डीएनए एक फ़िल्टरिंग जेल के माध्यम से आणविक गति की दर पर नज़र रखने के दौरान विद्युत प्रवाह का उपयोग करते हुए टुकड़े।
रंगहीन डीएनए नमूनों में नीले या नारंगी रंग की ट्रैकिंग डाई जोड़ने से आप अपना नमूना देख सकते हैं और वैद्युतकणसंचलन के दौरान डीएनए अणु कैसे चलते हैं, इसके बारे में जानकारी प्राप्त कर सकते हैं। पहचान अणुओं के प्रवास के बाद जेल पर डीएनए बैंड के आकार पर आधारित होती है।
जेल वैद्युतकणसंचलन कैसे काम करता है
जेल वैद्युतकणसंचलन आकार और विद्युत आवेश द्वारा डीएनए अणुओं को अलग करने और पहचानने के लिए विद्युत प्रवाह का उपयोग करके एक जेल के माध्यम से डीएनए के टुकड़े खींचता है। जेल अक्सर के साथ बनाया जाता है अगारोज पाउडर — से निकाला गया एक पॉलीसेकेराइड समुद्री सिवार.
Agarose को पानी और नमक के बफर घोल में मिलाया जाता है, और मिश्रण को गर्म किया जाता है और एक झरझरा जेल बनाने के लिए ठंडा किया जाता है जो वैद्युतकणसंचलन प्रक्रिया के दौरान फ़िल्टरिंग मैट्रिक्स के रूप में कार्य करेगा। जेल को फिर एक वैद्युतकणसंचलन इकाई में रखा जाता है और बफर समाधान के साथ कवर किया जाता है जो आचरण करता है
डीएनए और लोडिंग डाई युक्त घोल को जेल में छोटे कुओं में पिपेट किया जाता है जिसे जेल तैयार करने के दौरान बनाया जाना चाहिए। रंगोंआपकी मददनमूना स्पष्ट रूप से देखें कि आप वैद्युतकणसंचलन इकाई के नकारात्मक इलेक्ट्रोड के पास स्थित जेल कुओं में जोड़ रहे हैं।
एक सकारात्मक इलेक्ट्रोड विपरीत छोर पर स्थित है। डीएनए अंशों का एक ज्ञात मानक पहले कुएं में रखा गया है जो तुलना और पहचान के उद्देश्यों के लिए डीएनए बैंड की सीढ़ी बनाएगा।
डीएनए अणुओं की फॉस्फेट रीढ़ डीएनए को एक नकारात्मक चार्ज देती है। विपरीत इसलिए आकर्षित होते हैं, फलस्वरूप, डीएनए अणु सकारात्मक इलेक्ट्रोड की ओर आकर्षित होते हैं और विद्युत प्रवाह चालू होने पर चलना शुरू करते हैं, या "माइग्रेट" करते हैं।
छोटे आकार के डीएनए टुकड़े बड़े टुकड़ों की तुलना में तेजी से यात्रा करते हैं क्योंकि वे कम प्रतिरोध का सामना करते हैं क्योंकि वे जेल के झरझरा मैट्रिक्स के माध्यम से पलायन करते हैं। समान आकार के डीएनए टुकड़े जेल में डीएनए के बैंड बनाते हैं।
डाई उद्देश्य और महत्व लोड हो रहा है
डीएनए रंगहीन होता है, इसलिए जोड़ना ट्रैकिंग रंग एक नमूने के लिए आपकी मदद करता है आंदोलन की दर निर्धारित करें वैद्युतकणसंचलन के दौरान जेल में विभिन्न आकार के प्रोटीन अणु। डीएनए नमूने के साथ चलने वाले लोडिंग रंगों के उदाहरणों में शामिल हैं ब्रोमोफेनॉलनीला तथा जाइलीन सायनॉल।
चुनी गई डाई प्रतिक्रियाशील नहीं होनी चाहिए या डीएनए में परिवर्तन नहीं करना चाहिए। ब्रोमोफेनॉल ब्लू एक डाई है जिसका उपयोग छोटे आकार के डीएनए स्ट्रैंड्स को ट्रैक करने के लिए किया जाता है जिसमें लगभग 400 बेस पेयर होते हैं, जबकि ज़ाइलिन साइनॉल 8,000 बेस पेयर वाले बड़े डीएनए स्ट्रैंड्स के लिए बेहतर होता है। चुनी गई डाई प्रतिक्रियाशील नहीं होनी चाहिए या डीएनए में परिवर्तन नहीं करना चाहिए।
Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन में ग्लिसरॉल की भूमिका
के लिए अपना डीएनए नमूना तैयार करते समय वैद्युतकणसंचलन, आपको लोडिंग डाई के साथ ग्लिसरॉल और पानी मिलाना होगा। ग्लिसरॉल एक भारी, सिरप वाला पदार्थ है जो जेल शीट के एक छोर पर कुओं में डालने से पहले डीएनए नमूने को अधिक घनत्व देता है।
ग्लिसरॉल के बिना, डीएनए नमूना डूबने और कुएं में एक परत बनाने के बजाय फैल जाएगा जैसे कि डीएनए की सीढ़ी बनाने के लिए ऐसा करना चाहिए।
एसडीएस पेज में ट्रैकिंग डाई
सोडियम डोडेसिल सल्फेट पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) प्रोटीन और अमीनो एसिड को अलग करने के लिए उपयुक्त तकनीक है, जो रैखिक डीएनए अणुओं की तुलना में छोटे और अधिक जटिल होते हैं। वैद्युतकणसंचलन के लिए agarose जेल के बजाय Polyacrylamide (SDS PAGE gel) का उपयोग किया जाता है।
ब्रोमोफेनॉल ब्लू (BPB) को नमूना बफर में a. के रूप में जोड़ा जाता है ट्रैकिंग डाई जो प्रोटीन को अलग करने की एक ही दिशा में आगे बढ़ते हैं और उनके अग्रणी किनारे का सीमांकन करते हैं।
डीएनए-बाध्यकारी डाई की भूमिका
डीएनए-बाध्यकारी डाई जैसे नारंगी रंग का एथिडियम ब्रोमाइड को जेल या वैद्युतकणसंचलन बफर में जोड़ा जा सकता है। जैसा कि नाम से पता चलता है, डाई डीएनए अणु से जुड़ जाती है।
इस उत्परिवर्तजन डाई को संभालते समय बहुत सावधानी बरतनी चाहिए क्योंकि यह त्वचा की कोशिकाओं में डीएनए को बांध सकती है। ट्रैकिंग रंगों के विपरीत, एथिडियम ब्रोमाइड प्रतिदीप्त उज्ज्वल नीचे यूवी प्रकाश, डीएनए बैंड को दृश्यमान बनाना।