Polymeraasiketjureaktio tai PCR on tekniikka, joka valokopioi yhden DNA-fragmentin moniin fragmentteihin - eksponentiaalisesti moniin. Ensimmäinen vaihe on PCR: ssä on lämmittää DNA niin, että se denaturoi tai sulaa yksittäisiksi säikeiksi. DNA: n rakenne on kuin köysitikkaat, joissa pylväät ovat köysiä, joilla on magneettiset päät. Magneetit muodostavat yhteyden muodostamalla pylväät, joita kutsutaan pohjapareiksi, ja vastustavat siten vetämistä irti. Jokainen DNA-fragmentti sulaa yksittäisiksi säikeiksi eri lämpötiloissa. Ymmärtäminen, miten DNA: n rakenne pysyy yhdessä DNA: n yksittäisissä osissa, antaa käsityksen miksi erilaiset DNA-fragmentit sulavat eri lämpötiloissa ja miksi ensimmäisessä tarvitaan niin korkeita lämpötiloja paikka.
Sulaminen! Sulaminen!
PCR: n ensimmäinen vaihe on sulattaa DNA niin, että kaksijuosteinen DNA erottuu yksijuosteiseksi DNA: ksi. Nisäkäs-DNA: n osalta tämä ensimmäinen vaihe sisältää yleensä noin 95 asteen (noin 200 Fahrenheit) lämpöä. Tässä lämpötilassa vetysidokset A-T- ja G-C-emäsparien tai DNA-tikkaiden pylväiden välillä hajoavat toisistaan purkaen kaksoisjuosteisen DNA: n. Lämpötila ei kuitenkaan ole tarpeeksi kuuma murtamaan fosfaatti-sokerirunko, joka muodostaa yksittäiset säikeet tai tikapuiden navat. Yksittäisten säikeiden täydellinen erottelu valmistaa ne PCR: n toiseen vaiheeseen, joka jäähtyy, jotta lyhyet DNA-fragmentit, alukkeet, sitoutuvat yksittäisiin säikeisiin.
Magneettiset vetoketjut
Yksi syy siihen, että DNA kuumennetaan 95 celsiusasteen korkeaan lämpötilaan, on se, että mitä pidempi DNA: n kaksoisjuoste on, sitä enemmän se haluaa pysyä yhdessä. DNA: n pituus on yksi tekijä, joka vaikuttaa PCR: lle valittuun sulamispisteeseen kyseisessä DNA-kappaleessa. Kaksoisjuosteisessa DNA-sidoksessa olevat A-T- ja G-C-emäsparit pitävät kaksijuosteista rakennetta yhdessä. Mitä useammat peräkkäiset emäsparit kahden yksisäikeisen välillä ovat sitoutuneet, sitä enemmän heidän naapurinsa haluavat myös sitoutua, ja sitä vahvemmaksi vetovoima näiden kahden säikeen välillä tulee. Se on kuin pienistä magneeteista valmistettu vetoketju. Kun suljet vetoketjun, magneetit haluavat luonnollisesti vetää vetoketjussa ja pysyä vetoketjulla.
Vahvemmat magneetit tarttuvat tiukemmin
Toinen tekijä, joka vaikuttaa siihen, minkä sulamislämpötilan valita mielenkiinnon kohteena olevalle DNA-fragmentillesi, on siinä fragmentissa olevien G-C-emäsparien määrä. Jokainen peruspari on kuin kaksi minimagneettia, jotka houkuttelevat. G: stä ja C: stä tehty pari vetää paljon voimakkaammin kuin A- ja T-pari. Siten DNA-kappale, jolla on enemmän G-C-pareja kuin toisella fragmentilla, vaatii korkeamman lämpötilan ennen sulamista yksittäisiksi säikeiksi. DNA absorboi luonnollisesti ultraviolettivaloa - tarkalleen 260 nanometrin aallonpituudella - ja yksijuosteinen DNA absorboi enemmän valoa kuin kaksijuosteinen DNA. Joten absorboituneen valon määrän mittaaminen on tapa mitata, kuinka paljon kaksisäikeinen DNA on sulanut yksittäisiksi säikeiksi. G-C- ja A-T-emäsparien "magneettinen vetoketju" -vaikutus on kaavio, joka kuvaa kaksisäikeinen DNA, joka on piirretty lämpötilan nousua vastaan sigmoidiseksi, muotoiseksi S: ksi eikä a suora viiva. S: n käyrä edustaa ryhmätyön vastusta, jota emäsparit käyttävät lämpöä vastaan, koska he eivät halua erota.
Puolivälissä
Lämpötilaa, jossa DNA: n pituus sulaa yksittäisiksi säikeiksi, kutsutaan sen sulamislämpötilaksi, jota merkitään lyhenteellä "Tm". Tämä osoittaa lämpötilan, jossa puolet liuoksessa olevasta DNA: sta on sulanut yksittäisiksi säikeiksi ja toinen puoli on edelleen kaksisäikeinen muodossa. Sulamislämpötila on erilainen jokaiselle DNA-fragmentille. Nisäkkään DNA: n G-C-pitoisuus on 40%, mikä tarkoittaa, että loput 60% emäsparista ovat As ja Ts. Sen 40% G-C-pitoisuus saa nisäkkään DNA: n sulamaan 87 celsiusasteessa (noin 189 Fahrenheit). Siksi nisäkkään DNA: n ensimmäinen vaihe PCR: ssä on lämmittää se 94 celsiusasteeseen (201 Fahrenheit). Vain seitsemän astetta sulamislämpötilaa kuumempi ja kaikki kaksinkertaiset säikeet sulavat kokonaan yksittäisiksi säikeiksi.