Geelielektroforeesi on tekniikka, jossa biologiset molekyylit erotetaan toisistaan ja tunnistetaan biologisessa tutkimuksessa tai lääketieteellisessä diagnostiikassa. 1970-luvun kehityksestään lähtien nämä tekniikat ovat olleet korvaamattomia tunnistettaessa geenejä (DNA) ja geenituotteita (RNA ja proteiini), jotka kiinnostavat tutkimusta. Viime vuosina on tullut uudempia tekniikoita, jotka antavat enemmän täsmällisyyttä ja yksityiskohtia elävien järjestelmien tapahtumista. Vaikka nämä eivät ole syrjäyttäneet elektroforeesitekniikoita ja edistyneet manipulaatiot voivat lisätä tekniikan elinkelpoisuutta, on tärkeää ymmärtää, mitä geelielektroforeesi voi tehdä ja mitä ei.
Elektroforeesilla on rajoitettu näyteanalyysi
Elektroforeesi on spesifinen kudokselle, josta olet ottanut näytteen. Esimerkiksi, jos suoritat Southern-blotin (eräänlainen elektroforeesi) poskipyyhkeellä, katsot geenejä poskesi epiteelisoluista eikä missään muualla kehossasi. Toisinaan siitä voi olla hyötyä, mutta tutkijat ovat usein kiinnostuneita laajemmista vaikutuksista.
Tekniikat, kuten in situ -hybridisaatio (ISH), voivat ottaa osan kudoksesta ja analysoida geeniekspressiota kyseisen näytteen jokaisella pienellä alueella. Siksi tutkijat voivat tarkastella jokaista aivojen aluetta näytteessä ISH: lla, kun taas elektroforeesitekniikat voivat tarkastella vain muutamia alueita kerrallaan.
Elektroforeesimittaukset eivät ole tarkkoja
Geelielektroforeesi voi tehokkaasti erottaa samanlaiset proteiinit, joiden paino on erilainen (tätä tekniikkaa kutsutaan Western-blottaukseksi). Se voi erottaa ne tarkemmin tekniikalla, joka tunnetaan nimellä 2d-elektroforeesi; tämä on yleistä proteomiikassa.
Valitettavasti kaikki tällä tekniikalla tehdyt mittaukset ovat parhaimmillaan puolikvantitatiivisia. Proteiinien tarkan massan (painon) saamiseksi on käytettävä massaspektroskopiaa sen jälkeen, kun proteiini on puhdistettu elektroforeesilla. Lisäksi eri molekyylien suhteellisten määrien vertaaminen perustuu geelin eri pisteiden kaistatiheyteen (tummuuteen). Tällä menetelmällä on jonkin verran virheitä, ja näytteet suoritetaan yleensä useita kertoja puhtaiden tulosten saamiseksi.
Tarvitaan huomattava aloitusnäyte
Elektroforeesi on tekniikka erilaisten biomolekyylien eristämiseksi ja visuaaliseksi tunnistamiseksi. Tämä tapahtuu johtamalla sähkövirta geelin läpi eripainoisille varautuneille molekyyleille. Jos kiinnostunut molekyyli ei ole tarpeeksi yleinen, sen vyöhyke on käytännössä näkymätön ja sitä on vaikea mitata.
DNA ja RNA voidaan monistaa jonkin verran ennen elektroforeesin suorittamista, mutta ei ole käytännöllistä tehdä tätä proteiineilla. Siksi tarvitaan suuri kudosnäyte näiden määritysten suorittamiseksi. Tämä voi rajoittaa tekniikan hyödyllisyyttä, erityisesti lääketieteellisessä analyysissä. On melkein mahdotonta suorittaa elektroforeesi näytteistä yhdestä solusta; virtaussytometriaa ja immunohistokemiaa käytetään yleisemmin proteiinien solukohtainen ilmentymisen arvioimiseksi. PCR-tekniikka on erinomainen mittaamaan tarkasti pieniä määriä RNA: ta.
Vain tietyt molekyylit voidaan visualisoida
Elektroforeesi on erinomainen erottamaan ja tunnistamaan keskisuuret ja suuret biomolekyylit. Monet molekyylit, joita tutkijat haluavat tarkastella, ovat kuitenkin pienempiä; pieniä hormoneja, välittäjäaineita ja ioneja ei voida mitata elektroforeesilla. Tämä johtuu kahdesta syystä: ne eivät reagoi kunnolla elektroforeesivalmisteen kanssa (yleensä tekniikka kutsutaan SDS PAGE), ja vaikka he tekisivätkin, ne ovat liian pieniä erottaakseen kunnolla ja ryntäisivät ulos geeli. Nämä molekyylit mitataan sen sijaan tekniikoilla, kuten RIAA (radioimmunomääritykset) ja ELISA (entsyymiin liittyvä immunosorbanttimääritys).
Elektroforeesi on pienitehoinen
Geelielektroforeesi on yleensä alhainen läpäisykyky, mikä tarkoittaa, että se ei tuota tietoja erityisen nopeasti. Kontrastielektroforeesi, jossa voit tarkastella pienen kourallisen RNA-molekyylejä kerrallaan PCR: llä (polymeraasiketjureaktio), joka voi samanaikaisesti arvioida tuhansia näytteitä. Vastaavasti virtaussytometria voi tehdä mittauksia tuhansista yksittäisistä soluista ja tehdä monimutkaisista korrelaatioita, kun taas elektroforeesi tarkastelee soluja massaan eikä pysty tekemään niin hienoksi syrjinnät. PCR ja virtaussytometria edustavat massiivisesti rinnakkaisia ja sarjaprosesseja, ja molemmat ylittävät huomattavasti elektroforeesin kyvyt tuottaa tutkimustietoa.